РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ ТЕСТЫ — лабораторные методы идентификации и количественного определения T- или B-лимфоцитов, субпопуляций этих лимфоцитов и нек-рых других клеток, основанные на их способности фиксировать на своей поверхности эритроциты. Розеткообразующим лимфоцитом, или розеткообразующей клеткой (РОК), называют лимфоцит (гранулоцит, макрофаг и др.), к-рый фиксирует три и более эритроцитов (см. Иммунное прилипание). Расположение эритроцитов на поверхности РОК может быть различным: в одних случаях они образуют венчик, в других — неполный венчик, иногда РОК полностью окружена эритроцитами — такая розетка получила название «морула» (рис.). Иногда эритроциты располагаются в несколько слоев. В тех случаях, когда к РОК присоединено более 36 эритроцитов, розетки называют гигантскими. Феномен розеткообразования чаще всего используется для изучения поверхностных рецепторов на мембране лимфоцитов (см.).
Микропрепараты розеткообразующих лимфоцитов: а — лимфоцит с фиксированными на его поверхности тремя эритроцитами; б — лимфоцит с фиксированными на его поверхности эритроцитами, образующими венчик; в — лимфоцит, полностью окруженный эритроцитами, образующими так называемую морулу; 1 — лимфоцит; 2 — эритроциты.
Р. т. были введены в практику иммунол. и иммунохим. лабораторий в конце 60-х — начале 70-х гг. 20 в. для оценки иммунной реакции экспериментальных животных на иммунизацию ксеногенными эритроцитами. Затем Р. т. были применены для исследования лимфоцитов крови человека.
В зависимости от способа постановки Р. т. их делят на две группы: тесты спонтанного розеткообразо-вания и тесты непрямого розеткооб-разования. Ниже они рассматриваются на примере лимфоцитарного розеткообразования.
Тесты спонтанного розеткообразования
Спонтанное розеткообразование происходит при присоединении к поверхности лимфоцитов крови человека гетерологичных эритроцитов, чаще всего эритроцитов барана или мыши. Т-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы для эритроцитов барана (см. Иммунокомпетентные клетки). Образующиеся розетки получили название E-POR. Этот вид розеток наиболее исследован. В-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы, специфичные для эритроцитов мышей. Образующиеся розетки обозначают Ем-РОК. Этот тест менее изучен и меньше применяется в лаб. практике, чем тест на образование Е-РОК.
Тест на образование Е-РОК. Этим способом определяют общую популяцию Т-лимфоцитов. Методика постановки теста заключается в следующем: смешивают взвесь лимфоцитов с 30—100-кратным количеством эритроцитов; смесь инкубируют при 37° в течение 5 мин., затем центрифугируют и выдерживают при 4°; осторожно встряхивают и подсчитывают в камере Горяева процент лимфоцитов, образующих розетки; при этом розетки можно фиксировать глутаральдегидом, делать на стекле мазки, окрашивать их и подсчитывать относительное содержание Е-РОК. Одновременно подсчитывают абсолютное количество Е-РОК в единице объема исследуемого образца крови.
По данным многих исследователей, Е-РОК могут образовывать до 70% всех лимфоцитов крови человека. Отмечено снижение числа Е-РОК при ряде аллергических, аутоаллергических и инфекционно-аллергических заболеваний, что свидетельствует об угнетении механизма клеточного иммунитета (см.). Однако число Е-РОК не всегда адекватно состоянию клеточного иммунитета, поэтому требуются дополнительные методы исследования.
Небольшие изменения в методике постановки Р. т. позволяют определить не всю, а только часть популяции Т-лимфоцитов. По характеру образования Е-РОК различают следующие виды субпопуляций Т-лимфоцитов.
Субпопуляция Т-лимфоцитов с высокой связывающей активностью по отношению к эритроцитам барана образует так наз. активные Е-РОК. Эта популяция составляет ок. 22— 32% всех Т-лимфоцитов pi больше коррелирует с выраженностью клеточного иммунитета, чем общее количество Т-клеток, присоединяющих к своей поверхности эритроциты барана. Установлено, что такая субпопуляция Т-лимфоцитов не имеет на своей поверхности Fc-рецептора для IgG ит. о., очевидно, не обладает супрессорной активностью. Для выявления субпопуляции Т-лимфоцитов, образующих активные Е-РОК, на пробу берут меньшее количество эритроцитов и после центрифугирования пробу не выдерживают на холоде.
Если после центрифугирования взвесь инкубируют в течение 30 мин. при 37°, то происходит распад розеток. Обычно их остается до 3%. При активации Т-лимфоцитов при активном гепатите эта цифра увеличивается, при лечении глюкокор-тикоидными гормонами— снижается. Считают, что способность образовывать стабильные розетки более характерна для менее дифференцированных Т-лимфоцитов.
Т-лимфоциты здоровых людей образуют незначительное количество гигантских розеток. Их число увеличивается при постановке Р. т. с лимфоцитами, культивируемыми in vitro и стимулированными фитогемагглютинином.
Если заменить эритроциты барана ауто- или аллогенными эритроцитами человека, то выявляется способность Т-лимфоцитов образовывать розетки и с такими эритроцитами. Считают, что этой способностью обладает особая субпопуляция Т-лимфоцитов. Количество этих розеток зависит от методики постановки Р. т. Отмечено изменение их числа по сравнению с нормой при нек-рых опухолях и аутоаллергических заболеваниях.
Тест на образование Ем-РОК. Общий принцип постановки этого теста такой же, как и при постановке теста с Е-РОК, различие состоит лишь в том, что используются эритроциты мыши. Отмечено снижение или полное отсутствие образования розеток при агаммаглобулинемии и увеличение их образования при хрон. лимфолейкозе. У здоровых людей выявляется в среднем до 17% Ем-РОК.
Тесты непрямого розеткообразования
С помощью этих тестов на поверхности лимфоцитов человека выявляют различные рецепторы, не специфичные по отношению к эритроцитам. Поэтому к эритроцитам присоединяют так наз. вставочные компоненты, к-рые могут соединяться с тем или иным рецептором на поверхности лимфоцита. Эритроциты в этих случаях фиксируются на лимфоците через этот вставочный компонент. Поэтому такие Р. т. назвали тестами непрямого розеткообразо-вания. Различают следующие виды непрямого розеткообразования.
Тест на образование Fc-розеток (ЕА-розеток). На поверхности лимфоцитов, гранул оцитов, макрофагов и нек-рых других клеток человека имеются рецепторы, специфичные для Fc-фрагмента разных классов иммуноглобулинов (см.). На поверхности как В-лимфоцитов, так и Т-лимфоцитов они выявлены для IgG, IgM, IgA и IgE, причем различные субпопуляции Т- или В-лимфоцитов имеют Fc-рецепторы только для определенных иммуногобулинов. Есть данные, что Т-лимфоциты с Fc-рецептором для IgM — Tji-клетки могут выполнять функцию Т-хелперов (англ. helper помощник), способствуя пролиферации и дифференциации В-лимфоцитов в плазматические клетки (см.), а Т-лимфоциты с Fc-рецептором для IgG—Ту-клетки могут быть Т-супрессорами, тормозящими образование антител (см.) против собственных антигенов (см.). Для выявления клеток, несущих Fc-рецеитор, эритроциты крупного рогатого скота сенсибилизируют кроличьими антиэритроцитарными IgG- или IgM—антителами. Комплекс эритроцит — антитело, к-рый обычно обозначают EA (Е — эритроцит, А — антитело), добавляют к лимфоцитам и инкубируют. Живые лимфоциты образуют Fc-розетки (ЕА-розетки). У здоровых людей по данным разных исследователей, образование ЕА-розеток значительно варьирует, что объясняется отсутствием стандартного теста. При нек-рых патологиях, напр, при хрон. лимфолейкозе (см. Лейкозы), выявляются значительные отклонения в образовании ЕА-розеток по сравнению со среднестатистическими данными по норме.
Тест на образование комплементарных розеток (EАС-розеток). Лимфоциты людей имеют на своей поверхности два типа рецепторов к комплементу (С): иммуносвязывающие рецепторы — СЗЬ (фрагмент третьего компонента С) и С3с1-рецепторы (фрагмент рецептора СЗЬ), обладающие специфичностью к разным частям молекул СЗ и С4. Чаще всего оба рецептора присутствуют на лимфоцитах, имеющих рецептор, специфичный для С. Общим принципом определения этого вида лимфоцитов является сенсибилизация эритроцитов барана кроличьими антиэритро-цитарными IgM-антителами и добавление комплемента человека. Образовавшийся комплекс ЕАС (Е — эритроциты, А — антитела, С — комплемент) соединяют со взвесью лимфоцитов. Сенсибилизированные эритроциты фиксируются на лимфоцитах через комплемент. Образуются розетки, к-рые получили название «ЕAC-розетки». Существуют различные модификации этого теста с использованием эритроцитов других видов животных и человека, а также комплемента (см.) (напр., комплемента мыши), что позволяет выявлять тот или иной комплементарный рецептор. Считают, что ЕАС-клетки являются скорее всего В-лимфоцита-ми, однако рецептор, специфичный для СЗ, имеется также на Т-лимфоцитах, «ноль-клетках» и моноцитах. Определяемое методом ЕАС-розеток количество лимфоцитов в крови человека зависит от методики и колеблется от 15% до 25%.
Тест на образование антигенсвязывающих розеток. С помощью этого теста выявляют сенсибилизированные лимфоциты, связывающие антигены собственных тканей. Розетки вокруг сенсибилизированных лимфоцитов образуются эритроцитами человека, нагруженными теми или иными тканевыми антигенами. При нек-рых коллагенозах (см. Коллагеновые болезни) установлено увеличение количества таких розеток.
Тест на образование гистаминовых розеток. Ок. 30% В-лимфоцитов и 10% Т-лимфоцитов крови человека имеют на своей поверхности специфичный в отношении гистамина рецептор. Он выявляется на дифференцированных Т- и В-клетках. В популяции Т-лимфоцитов этот рецептор может служить маркером зрелых клеток, обладающих супрессорной или цитотоксической активностью. Для выявления лимфоцитов, несущих гистаминовый рецептор, на эритроцитах фиксируют гистамин, а затем эти эритроциты смешивают с лимфоцитами. Образуются розетки, в к-рых эритроциты фиксируются на поверхности лимфоцита с помощью гистамина.
Тест на образование аденозиновых розеток. Ок. 11% лимфоцитов крови человека содержат рецепторы, специфичные для аденозина. Для их выявления на эритроцитах крупного рогатого скота фиксируют комплекс аденозин — сывороточный альбумин человека и смешивают его с лимфоцитами. За счет связывания аденозина с соответствующими рецепторами на поверхности лимфоцитов образуются розетки. Эта группа лимфоцитов относится гл. обр. к Т-лимфоцитам.
Библиография: Лимфоциты, выделение, фракционирование и характеристика, под ред. Дж. Б. Натвига и др., пер. с англ., М., 1980; Патогенез аллергических процессов в эксперименте и клинике, под ред. А. М. Чернуха и В. И. Пыцкого, с. 285, М., 1979; Петров Р. В., Борисова А. М. и Абаскулиева Э. К. Использование метода розеткообразования для оценки Т- и В-систем иммунитета у больных ревматизмом, Тер. арх., т. 50, № 12, с. 99, 1978, библиогр.; Петров Р. В., Стенина М. А. и Лебедев К. А. Особенности оценки количества Т-лимфоцитов и других розеткообразующих клеток в крови здоровых и больных людей, Бюлл. эксперим. биол. и мед., т. 81, №2, с. 197, 1976, библиогр.; Dolen J. G. a. Park В. Н. An improved micro-method for enumeration of human В-cell rosettes with mouse red blood cells, Immunol. Commun., v. 7, p. 677, 1978; Harada М. a. Mattori K. Heterogeneity of human peripheral T lymphocytes, Allerg. Immunopathol., v. 6, p. 65, 1978, bibliogr.; Morоz Ch. a. o. Human adenosine receptor bearing lymphocytes, enumeration, characterization, and distribution in peripheral blood lymphocytes, Clin. Immunol, a. Immunopathol., v. 18, p. 47, 1981, bibliogr.; Saxon A.,Morledge V. D. a. Bonavida B. Histamine-receptor leucocytes (HRL), Organ and lymphoid subpopulation distribution in man, Clin, exp. Immunol., v. 28, p. 394, 1977.
М. В. Егорова.
