БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДИКИ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ METOДИКИ — совокупность методов и технических приемов, применяющихся для обнаружения и выделения патогенных или условно патогенных бактерий от больных, носителей или из объектов внешней среды.

Бактериологические методики совершенствовались и обогащались в ходе исторического развития микробиологии и ее отдельных отраслей. Характер бактериологических методик определяется целью исследования, условиями обитания микробов в исследуемом объекте, их биологическими свойствами, а также патогенезом заболевания, при котором проводится бактериологическое исследование. Например, при заболеваниях, сопровождающихся бактериемией, лучшим методом обнаружения возбудителя является посев крови больного. При наличии выраженных местных поражений (дифтерия, дизентерия, гонорея и др.) производят посев отделяемого или выделений из органа, в котором локализуются бактерии. Какие бы задачи ни стояли перед исследователем, они в основном выполняются с помощью одних и тех же бактериологических методик, применяемых в определенной последовательности для выделения и определения микроорганизмов.

Выделение бактерий из исследуемого материала во многом зависит от правильности его сбора. Характер и методика взятия и пересылки материала при различных инфекционных заболеваниях не одинаковы, но существуют общие положения, которые необходимо учитывать независимо от объекта исследования и свойств материала.

1. Исследуемый материал, по возможности, собирают в асептических условиях в стерильную посуду, руководствуясь при этом целями и задачами данного исследования. Например, при исследовании на анаэробы материал берут из глубоких слоев тканей, при диагностике дифтерии необходимо следить за тем, чтобы тампоном был сделан мазок с миндалин, а не поверхностное прикосновение к ним.

2. При взятии исследуемого материала должен быть составлен соответствующий документ, в котором следует указать дату взятия, характер материала, источник и точно определить цель исследования.

3. Исследуемый материал необходимо, по возможности, быстро доставить в лабораторию. Длительное хранение материала приводит к гибели бактерий и снижает вероятность их обнаружения.
4. При необходимости до пересылки в лабораторию материал, подлежащий исследованию, хранят в прохладном месте.

5. Доставленный в лабораторию исследуемый материал подлежит быстрейшему исследованию.

Бактериоскопическое исследование (бактериоскопия) изучаемого материала — одна из распространенных бактериологических методик. В лабораторной практике применяют микроскопию нативных и фиксированных препаратов. В первом случае препараты готовят из свежего необработанного материала, который наносят на чистое предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Предметные стекла для препаратов должны быть прозрачными, чистыми и обезжиренными, иметь толщину 1 — 1,2 мм. Обработку и очистку стекол проводят различными способами; один из них описан ниже. Сначала стекла кипятят в 1% растворе соды, затем промывают водой, соляной кислотой и в заключение еще раз тщательно водой. Стекла хранят в 95% спирте в банке с притертой пробкой или протертыми досуха в закрытых сосудах. В ходе микроскопии нативных препаратов, приготовленных из чистых бактериальных культур, можно идентифицировать у бактерий ряд морфологических структур по их гистохимическим свойствам, используя для этого витальную окраску, например, наличие капсулы при окраске разведенными растворами метиленового синего. Прижизненную микроскопию бактерий осуществляют также в препаратах — висячая капля (см.).

Более широко применяется бактериоскопия фиксированных препаратов. На чистое обезжиренное стекло наносят каплю стерильной воды, в которую вносят прокаленной и остуженной бактериальной петлей исследуемый материал.

Каплю с материалом распределяют по стеклу равномерным тонким слоем. Остаток материала на петле уничтожается прокаливанием. Плотный исследуемый материал (мокрота, гной и др.) наносят на предметное стекло и покрывают вторым стеклом так, чтобы концы остались свободными. Плотно прижав стекла друг к другу, раздавливают материал и раздвигают стекла в стороны, получая при этом два равномерных мазка (рис. 1). Кровь и другие жидкие объекты наносят по средней линии стекла ближе к одному из концов. Стекло помещают горизонтально, придерживая за его ребра. Шлифованное предметное (или покровное) стекло подводят к капле под углом в 45°; после того как капля растечется, его двигают по предметному стеклу (рис. 2). Полученный мазок должен быть уже, чем предметное стекло, равномерным по плотности, с ровными краями.

Из органов или бактериальных колоний и других объектов готовят также препараты-отпечатки. Кусочек органа, фиксированного пинцетом, прикладывают поверхностью разреза к предметному стеклу по средней линии, а отпечатки колоний бактерий делают на покровном стекле.

Приготовленные препараты высушивают при комнатной температуре или в термостате. Нефиксированный препарат заразен, поэтому при работе с ним необходимо тщательно соблюдать правила предосторожности, не прикасаться к поверхности стекла руками. Высушенный препарат фиксируют к поверхности стекла. При фиксации препарата происходит одновременно его обеззараживание. В бактериологической практике наиболее распространенным методом фиксации является фламбирование— фиксация жаром в пламени горелки. Для этого препарат мазком вверх троекратно проводят через пламя. Действие пламени должно продолжаться в среднем 2—3 секунды. Длительная фиксация жаром снижает качество препарата, а недофиксированные препараты при последующей обработке смываются и таят в себе опасность заражения. При изучении некоторых деталей структуры бактерий, а также мазков крови, отпечатков органов используют фиксирующие жидкости, применяемые в гистологической практике (метиловый спирт, этиловый спирт, спиртформол, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.). После этого препараты окрашивают (см. Окраска микроорганизмов) и изучают с помощью микроскопа.

Методом бактериоскопии широко пользуются для бактериологической диагностики туберкулеза, гонореи, возвратного тифа и других инфекционных заболеваний.

Посевы и пересевы бактериальных культур являются одним из основных элементов бактериологических методик. Техника пересева бактерий на скошенный агар сводится к следующему. Пробирки с культурой или другим посевным материалом и незасеянной средой берут в левую руку так, чтобы пробирка с культурой была ближе к работающему, а незасеянная со средой — дальше от него. Поверхности агара должны быть обращены кверху. В правую руку берут бактериальную петлю и прокаливают ее в пламени горелки, проводя через пламя и часть рукоятки петледержателя (см. Петля бактериальная). Следят за тем, чтобы прокаленная петля ни к чему не прикасалась. После этого ватные пробки пробирок захватывают под мизинец правой руки, вынимают и держат так, чтобы во время посева они также ни к чему не прикасались. Обжигая края открытых пробирок в пламени горелки, простерилизованную петлю вводят в пробирку с культурой. Петлей прикасаются к участку незасеянного агара, и если он при этом не расплавляется, то это означает, что проволока достаточно охлаждена. Если же агар плавится, то петлю, не вынимая из пробирки, остужают. Остуженной петлей прикасаются к поверхности бактериального роста, легким скользящим движением набирают культуру на петлю и быстро переносят ее в незасеянную пробирку. При переносе нельзя прикасаться петлей к краям и стенкам обеих пробирок. Петлю с культурой опускают в конденсационную воду и производят посев, растирая материал по поверхности агара (рис. 3). Вынув петлю, обжигают края пробирок и над пламенем закрывают их пробками. Петлю стерилизуют прокаливанием в пламени горелки и ставят в штатив. Техника посева на жидкие питательные среды в основном такая же, как и при посеве на твердые среды. При работе с жидкими средами необходимо следить, чтобы жидкость не выливалась из пробирок и не смачивала их края и ватные пробки, поэтому питательные среды и культуры никогда нельзя держать в горизонтальном положении.

В некоторых случаях (культивирование анаэробов, выявление протеолитических свойств) производят посев уколом в толщу питательной среды — агара или желатины столбиком, для чего бактериальной петлей или специальной иглой с засеваемой культурой прокалывают питательную среду до дна. При этом пробирку можно держать дном кверху (рис. 4). После посева обжигают края пробирки и в то же время над пламенем закрывают ее пробкой. Иглу прокаливают и ставят в штатив.

Посев жидких материалов на питательные среды можно производить также пастеровской пипеткой (см. Пастера пипетка). У стерильной пипетки пинцетом отламывают запаянный конец, проводят ее 2—3 раза через пламя горелки, дают остыть и, соблюдая указанные выше правила, набирают небольшое количество посевного материала, который вносят в пробирку со свежей средой. В остальном действуют так же, как и при посеве петлей. Использованную пипетку помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором.

Пробирки со средой, в которые был произведен посев, нужно тотчас же надписать. В надписи указывают дату посева и характер посевного материала. Засеянные и надписанные пробирки помещают в термостат для культивирования бактерий.

Выделение чистых культур. В естественных условиях бактерии в подавляющем большинстве случаев находятся не изолированно, а в виде бактериальных смесей. Поэтому при исследовании того или иного объекта приходится учитывать возможность присутствия нескольких видов микробов. Вместе с тем для исследования и практических целей необходимо работать с чистой бактериальной культурой (см.), то есть с популяцией, содержащей бактерии одного вида. Все методы выделения чистых культур из микробных смесей можно разделить на две основные группы: 1) методы, основанные на механическом принципе разделения микробов; 2) биологические. Методы первой группы в свою очередь подразделяют: а) на методы, в основу которых положено разделение смеси на отдельные бактериальные клетки по поверхности питательной среды, и б) методы изолирования отдельных бактериальных клеток в микроманипуляторе под контролем глаза. Выделение чистой культуры на твердых питательных средах может быть осуществлено путем рассева испытуемого материала по поверхности или в толще среды. Наиболее часто пользуются первым способом. И в том, и в другом случае добиваются такого разведения материала, чтобы при последующем рассеве его по поверхности плотной питательной среды отдельные бактерии оказались достаточно далеко друг от друга на изолированных участках, где они размножаются. При этом формируются изолированные бактериальные колонии при пересеве которых и получается чистая культура.

Метод рассева по поверхности плотной среды. Берут три чашки Петри (см. Петри чашка) со стерильной плотной питательной средой. Каплю исследуемого материала петлей или пастеровской пипеткой наносят на питательную среду в первой чашке, а затем стеклянным или платиновым шпателем тщательно размазывают по всей поверхности (рис. 5). Не обжигая шпателя, оставшийся на нем материал переносят последовательно во вторую и третью чашки и размазывают по поверхности питательной среды. Рассев материала можно делать также с помощью петли. При внесении материала не рекомендуется полностью снимать крышку чашки, а лишь слегка приоткрывать ее. После рассева чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат.

Метод рассева в глубине среды имеет более ограниченное значение, чем предыдущий, и применяется лишь в том случае, если необходимо подсчитать количество бактерий в определенном относительно большом объеме испытуемого материала (вода, гной и пр.). При данном методе применяют только желатину и агар. В водяной бане в трех пробирках среду растапливают, а затем охлаждают до t° 45°. В первую пробирку вносят определенный объем исследуемого материала; тщательно размешав его в жидком агаре, такой же объем из первой пробирки переносят во вторую, а из нее такой же объем в третью, каждый раз тщательно размешивая содержимое пробирки. Затем содержимое каждой пробирки выливают в чашку Петри (рис. 6). Когда агар в чашках затвердевает, их переворачивают вверх дном, надписывают и помещают в термостат.

В обоих описанных методах на первой чашке, где был засеян концентрированный материал, бактериальные клетки могут оказаться настолько близко друг к другу, что при последующем культивировании отдельные колонии сольются и дадут скученный газонный рост. Во второй и третьей чашках, в которых количество попавших туда бактерий значительно меньше, образуются отдельные колонии (рис. 7). Если предполагается, что концентрация бактерий в исходном материале настолько велика, что во второй и третьей чашках сформируется газонный рост, то исходный исследуемый материал до посева нужно развести физиологическим раствором или жидкой питательной средой. После пребывания чашек с посевами в термостате в течение определенного времени, зависящего от вида бактерий, приступают к выделению чистой культуры. При этом исходят из положения, что каждая изолированная колония представляет собой потомство одной бактериальной клетки, попавшей на отдельный участок питательной среды. Выделение чистой культуры из колонии заключается в ее исследовании и посеве на свежую питательную среду.

Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете того или иного свойства выделяемого микроба, отличающего его от других, находящихся с ним в исследуемом материале. В качестве примеров использования биологических особенностей бактерий для выделения чистых культур можно указать следующие.

1. Выделение чистой культуры подвижных бактерий по методу Шукевича. Испытуемый материал, из которого выделяется подвижный микроб, засевается в конденсационную воду косого агара; при этом необходимо следить, чтобы петля с материалом не коснулась поверхности агара над конденсационной водой. Бактерии, обладающие подвижностью, вырастают не только в конденсационной воде, но и вне ее на поверхности агара. Из верхней части роста производится высев в конденсационную воду свежей питательной среды. Произведя таким образом несколько пересевов, в конце концов получают чистую культуру подвижной бактерии.

2. Выделение чистой культуры путем использования различной чувствительности бактерий к высоким и низким температурам. Некоторые бактерии образуют споры, устойчивые к высоким температурам (80—100°); этим можно воспользоваться для выделения чистой культуры спорообразующей бактерии, находящейся в смеси с неспорообразующими. Для этого исследуемый материал прогревают в течение 10 минут при t° 80° или 2—3 минуты при t° 100°, а затем производят высевы на чашки с агаром. После инкубации в термостате на чашках образуются колонии спорообразующих бактерий.

3. Для облегчения выделения чистых культур некоторых бактерий можно воспользоваться тем, что они растут при различных температурных оптимумах. Например, для выделения кишечной палочки из воды выращивание проводят при t° 45°; при этой температуре сопутствующие микробы размножаются очень медленно.

Выделение чумного микроба из загрязненного материала проводят путем выращивания при t° 20° и даже 5°. В последнем случае рост хотя и задерживается, но в значительно меньшей степени, чем сопутствующих бактерий.

4. Выделение чистых культур на основе различных биол, свойств бактерий широко проводится на так называемых избирательных (элективных) питательных средах (см. Дифференциально-диагностические среды).

5. Для выделения чистых культур некоторых бактерий (пневмококк, туляремийная палочка, палочка сибирской язвы и др.) можно пользоваться методом заражения животного, чувствительного к данной инфекции. Например, для выделения пневмококка из мокроты заражают белую мышь, которая весьма чувствительна к данному микробу и резистентна к другим бактериям, находящимся в мокроте. Пневмококк быстро размножается в организме мыши, а другие микробы погибают. Через 18—20 часов после заражения мышь забивают и кровь, взятую из сердца, засевают на питательную среду. Так как в крови содержится только пневмококк, на питательной среде вырастает чистая культура.

Выращивание бактерий. Все бактерии по отношению к температуре принято подразделять на 3 основные группы: психрофильные, мезофильные и термофильные.

К группе психрофильных обычно относятся микроорганизмы, выделяемые из воды холодных источников, озер, морей и океанов. Оптимальная температура для них 20°, а для некоторых даже 5°. Температурный оптимум мезофильных бактерий, к которым относится большинство патогенных, лежит в пределах 34—37°. И, наконец, оптимум роста термофильных бактерий находится выше оптимума мезофилов. Некоторые представители этой группы растут при высоких температурах, достигающих 65—70°.

Для создания оптимальных температурных условий применяют специальные приборы — термостаты (см. Термостат), в которых и выращивают бактерии. В условиях больших лабораторий используют оборудованные термостатные комнаты. Продолжительность выращивания зависит от вида бактерий. Большинство бактерий выращивается при оптимальных температурах в течение 24 часов. Некоторые виды инкубируются значительно более продолжительное время: возбудитель коклюша в течение 2— 4 суток, а туберкулезная палочка даже 2—3 недели. Длительность инкубации того или иного микроба определяется динамикой роста и размножения данной бактерии и зависит от качества питательной среды.

Глубинное выращивание бактерий — см. Аэрация, в микробиологии. Культивирование анаэробов — см. Анаэробы.

Следующим элементом бактериологических методик является идентификация выросших в термостате микробов (см. Идентификация микробов).

Данные, получаемые в результате исследования микроорганизмов, должны быть отмечены в журнале. Только сопоставление всех признаков бактерий, выявленных при изучении их морфологических, биохимических, серологических, а где нужно и биол, свойств, может служить основанием для идентификации. Обнаруженные отклонения от типичной характеристики оцениваются в связи со значимостью атипичных свойств для идентификации данного микроба. Подробные записи позволяют также сравнить микробы, выделяемые при однородных условиях или у одного и того же больного. Наконец, материал, собранный в текущих исследованиях практической лаборатории, может быть подвергнут научной обработке и обобщению, если он тщательно запротоколирован. Журнал для протоколирования должен содержать графы для записи происхождения исследуемого материала, условий его сбора, краткой характеристики внешнего вида, результатов первичного посева, изучения морфологии выделенного микроба, его ферментативной активности, результатов серологического исследования и, наконец, для указания судьбы культуры (уничтожена, оставлена для изучения, передана). Необходимо также ввести графу для ответа по исследованию.

См. также Бактерии.

Библиогр.: Мейнелл Д. и Мейнeлл Э. Экспериментальная микробиология, пер. с англ., М., 1967, библиогр.; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, М., 1973; Саха* ров П. П., Метелкин А. И. и Г у д к о в а Е. И. Лабораторные животные, М., 1952; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М. О. Биргера, М., 1973; Тимаков В. Д. и Гольдфарб Д. М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии, М., 1958; Флорин-с к и й А. В. Новые технические приемы лабораторных исследований, М., 1954; Bacteria, ed. by I. C. Gunsalus a. R. Ύ. Sta-nier, v. 1 —5, N. Y.— L., 1960—1964; Identification methods for microbiology, ed. by В. M. Gibbs a. F. A. Skinner, v. i_2, L.— N. Y., 1966—1968; Laboratory methods in microbiology, ed. by W. F. Harrigan а. М. E. Me Cance, L.— N. Y., 1966, bibliogr.