БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Биохимические методы исследования (в диагностике) — методы исследования химических компонентов биологических жидкостей, клеток и тканей, а также процессов превращения веществ и энергии, протекающих в организме человека в норме и патологии. Для целей клинической диагностики представляет интерес: химический состав биологических жидкостей и тканей организма (патология может проявляться изменением концентрации, или отсутствием одного из обычных компонентов, или появлением необычного компонента), распределение жидкости и химических компонентов между различными «структурами» организма и отдельной клетки, процессы превращения химических компонентов в целом организме или различных его органах и их регуляция с помощью медиаторов, гормонов, тканевых гормонов, ферментов; процессы обмена организма с внешней средой. Исследованию подвергаются входящие в состав живых организмов неорганические, органические вещества и макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Исследование может проводиться in vitro в пробах биологических жидкостей (кровь, моча, цереброспинальная жидкость, нот, пищеварительные соки и т. д.), патологических жидкостей (отечной, асцитической, плевральной, перикардиальной, внутрисуставной и т. д.) или ткани, а также выдыхаемого воздуха, in vivo с помощью введенных в организм датчиков (ионоселективных электродов).
В диагностической практике наибольшее распространение получили Биохимические методы исследования отдельных химических компонентов, их соединений и соотношений между ними в пробах биол, жидкостей (кровь, моча и т. д.). В зависимости от характера исследования Биохимические методы исследования могут быть разделены на качественные (обнаружение искомого вещества в пробе биол, жидкости или ткани) и количественные (определение или измерение его содержания). Качественные методы (см. Аналитическая химия) большей частью основаны на использовании характерного для исследуемого вещества свойства, проявляющегося при определенном хим.-физ. воздействии (прибавление соответствующего реагента, нагревание и т. п.). Этот же принцип лежит в основе прямых количественных методов исследования. Однако поскольку состав биол, жидкостей довольно сложен, при количественном определении хим. компонента обычно в качестве первого этапа исследования выделяют из биол, жидкости искомое вещество (или группу близких веществ), а затем идентифицируют его (по тому или иному характерному свойству) и измеряют содержание (концентрацию). В ряде случаев разделение веществ, идентификация и измерение концентрации могут быть проведены одномоментно, напр, при исследовании биол, жидкости методом газовой хроматографии (см. Хроматография). Принципы химических, физических и физико-химических методов, применяемых при биохим, анализе, приведены в табл. 1 и 2.
При исследовании ферментов большей частью измеряют не их концентрацию, а результат проявления их каталитической активности (уменьшение содержания субстрата или увеличение содержания продукта реакции, катализируемой ферментом). Ряд веществ, обладающих высокой биол, активностью, но содержащихся в организме в малых количествах (гормоны, медиаторы), выделяют тем или иным хим. способом, а измерение содержания (концентрации) производят с помощью биол, тест-объектов (изолированных органов или целых организмов экспериментальных животных), что повышает чувствительность и специфичность исследования. В последнее время эти биол, методы вытесняются радиоиммунологическими.
Совершенствование Б. м. и. направлено на получение наиболее точной информации о состоянии процессов обмена вещества в целом организме, в определенном органе, в отдельной клетке, в субклеточных структурах. Б. м. и. при этом сочетаются с методами иммунологии, гистологии, цитологии и др. Такие методы обычно сложны, трудоемки, требуют специального оборудования.
Другим направлением развития Биохимических методов исследования, невызываемого запросами клинической диагностики, является разработка и применение максимально упрощенных по технике выполнения и быстрых методов, позволяющих в течение нескольких минут и даже секунд получить приближенную (ориентировочную) оценку определенного биохимического показателя. Б. м. и. могут осуществляться с помощью частично или полностью механизированных систем, автоматических измерительных приборов, автоанализаторов (см.). Как выделение вещества из биол, жидкости, так и измерение его концентрации может быть осуществлено различными способами. Комбинации этих способов, представляющие собой конкретные методы исследования, довольно многочисленны. В отношении некоторых веществ (холестерин, холинэстераза) описано до 100—150 вариантов методов исследования. Известная специфика метода исследования может быть обусловлена характером исследуемой биол, жидкости в зависимости от концентрации белка, пигментов и т. п. Наряду с однократными исследованиями в диагностике представляет интерес изучение того или иного показателя в динамике — в течение суток (оценка нормального суточного ритма), под влиянием определенной функциональной нагрузки (выявление скрытых дефектов метаболизма), в процессе развития болезни, под влиянием лечения. В связи с многообразием биохимических процессов, одновременно протекающих в процессе жизнедеятельности организма, в практике все шире применяются комбинации диагностических тестов, отражающих ту или иную форму патологии, поражение определенного органа, глубину или стадию патологического процесса.
Применение Б. м. и. в диагностике предъявляет к ним особые требования: использование минимального объема биол, материала, быстрое выполнение анализа, возможность многократного применения при проведении функциональных проб, отсутствие влияния лечебных препаратов на результаты исследования и т. д. При оценке Б. м. и. учитывается: правильность и воспроизводимость результатов от одного определения к другому, точность полученного результата истинному содержанию искомого вещества в пробе, специфичность (способность выявлять вещество независимо от присутствия других веществ) и предел чувствительности (наименьшее количество вещества, к-рое можно определить данным методом).
Разнообразие Биохимических методов исследования предоставляет возможность выбора метода, оптимально соответствующего задачам и условиям научного исследования. В практической деятельности клинико-диагностических лабораторий более целесообразно использовать тщательно отобранные унифицированные методы, единые для всех леч.-проф, учреждений страны, что позволяет сравнивать результаты анализов, проведенных одному и тому же больному в разных учреждениях, и облегчает материально-техническое снабжение лабораторий. В СССР проводится планомерная унификация наиболее часто применяемых в диагностических целях Б. м. и. с учетом научно-мед. и экономических критериев. Отечественная номенклатура лабораторных диагностических исследований насчитывает 150 биохимических тестов.
Таблица 1. Принципы методов разделения и выделения веществ, содержащихся в биологическом материале
Свойство, используемое для разделения веществ | Методы разделения и выделения | Свойство, используемое для разделения веществ | Методы разделения и выделения |
Различие температур перехода вещества из одного состояния | 1. Перегонка (дистилляция) 2. Микродиффузия (изотермическая 3. Выпаривание (высушивание) 4. Сублимация | Различие распределения между подвижной и неподвижной (продолжение) | 10.2.2. Разделительная (жидкая стационарная фаза) 10.2.2.1. Жидкостно-жидкостная 10.2.2.2. Газо-жидкостная 10.3. 10.3.1. Гельфильтрация 10.3.2. Гельхроматография 10.3.3. Разделение без различия величины 10.4. По технике осуществления 10.4.1. Колоночная 10.4.2. Тонкослойная 10.4.3. Бумажная |
Различие растворимости | 5. Экстракция 6. Противоточное распределение 7. Фракционное осаждение (по видам 7.1. Нейтральные соли 7.2. Гидрофильные органические 7.3. Водорастворимые недиссоциирующие 7.4. Тяжелые металлы и их гидроокиси 7.5. Органические катионы 7.6. Анионы и полианионы 7.7. Иммунопреципитация | ||
Различие в электрическом заряде молекул | 11. Электрофорез 11.1. Свободный 11.2. На носителях 11.2.1. На бумаге 11.2.1.1. Простой 11.2.1.2. Высоковольтный 11.2.2. На геле агара 11.2.3. На геле агарозы 11.2.4. На крахмальном геле 11.2.5. На полиакриламидном геле 11.2.5.1. Простой 11.2.5.2. Диск-электрофорез 11.2.5.3. Пластинчатый 11.2.6. На пленке (ацетатоцеллюлозы) 11.2.7. На тонком слое 12. Комбинированный электрофорез 12.1. Электрофорез + иммунодиффузия 12.2. Электрофорез + хроматография | ||
Различие скорости седиментации | 8. Седиментационный анализ 8.1. Центрифугирование 8.2. Ультрацентрифугирование 8.2.1. При разных скоростях осаждения 8.2.2. Изопикническое 8.2.3. При зональных роторах | ||
Различие величины молекул | 9. Диализ 9.1. При равном давлении 9.2. При повышенном давлении 9.3. При пониженном давлении 9.4. Электродиализ 9.5. Диализ через нестационарную | ||
Различие в электрическом заряде молекул при определенной | 13. Изоэлектрическое фокусирование в градиенте pH 13.1. Свободное 13.2. Зональное 13.3. В геле 13.4. Иммуноэлектрофокусирование | ||
Различие распределения между подвижной и неподвижной | 10. Хроматография 10.1. По виду процессов разделения 10.1.1. Элюционная 10.1.2. Фронтальный анализ 10.1.3. Вытеснительная 10.1.4. Термохроматография 10.2. По принципу разделения и стационарной фазе 10.2.1. Адсорбционная (твердая 10.2.1.1. Жидкостно-адсорбционная 10.2.1.2. Ионообменная 10.2.1.3. Газо-адсорбционная | ||
Различие подвижности в электрическом и магнитном поле | 14. Диэлектрофорез |
Таблица 2. Методы количественного анализа, используемые в биохимических исследованиях
Физико-химические свойства веществ, используемые в анализе | Методы определения (измерения) | Физико-химические свойства веществ, используемые в анализе | Методы определения (измерения) |
Экстенсивные свойства Масса (вес) Объем | 1. Гравиметрия (весовые методы) 2. Волюмометрия 2.1. Газоволюмометрия 2.2. Титриметрия 2.2.1. Нейтрализационный анализ 2.2.2. Редоксиметрия 2.2.3. Комплексометрия, в т. ч. 2.3.Объемная седиментометрия | Взаимодействие вещества с лучистой энергией Поглощение лучистой энергии: рентгеновских лучей, Рассеяние и отражение света Преломление световых лучей (показатель преломления) | 19. Адсорбционная спектроскопия (спектрофотометрия) 19.1. Рентгеноспектрофотометрия 19.2. В ультрафиолетовом свете 19.3. В видимом свете 19.4. В инфракрасном свете 19.5. Атомно-адсорбционная 20.1. Нефелометрия 20.2. Турбидиметрия 21.1. Рефрактометрия 21.2. Интерферометрия 22. Поляриметрия 23. Электронная парамагнитнорезонансная 24. Ядерная магнитнорезонансная 25. Масс-спектрометрия |
Механические свойства Плотность (уд. вес) Вязкость Осмотическое давление | 3. Денсиметрия 4. Вискозиметрия δ. Осмометрия 5.1. Прямая осмометрия 5.2. Криоскопия | ||
Термические свойства Температура фазовых превращений (плавления, кипения, Теплота реакций (сгорания, нейтрализации) Теплопроводность (газа) | 6. Термометрия 6.1. Термометрия 6.2. Термогравиметрия 6.3. Дифференциальный термический анализ 7. Калориметрия 8. Термокондуктометрия | Дифракция рентгеновских лучей и электронов Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) Отклонение ионизированных | |
Электрические свойства Электропроводность Диэлектрическая проницаемость Магнитная восприимчивость Сила диффузионного тока на электроде при реакции Количество электричества для реакции на электроде | 9. Кондуктометрия 10. Диэлкометрия 11. Импедансометрия 12. Электроспектроскопия 13. Абсорбционная импедансометрия 14. Магнитометрия 15. Амперометрия 16. Полярография 16.1. При контролируемом напряжении 16.2. При контролируемом токе 16.3. При отслаивании вещества с анода 16.4. Пульсационная 17. Кулонометрия 18. Потенциометрия 18.1. С обычными электродами 18.2. Сион-селективными электродами 18.2.1. Мембрана из специального стекла 18.2.2. Твердая мембрана 18.2.2.1. Гомогенная 18.2.2.2. Гетерогенная 18.2.3. Жидкая мембрана 18.2.3.1. Ион-селективный компонент 18.2.3.2. Ион-селективный компонент 18.2.4. Мембрана с закрепленным | Испускание излучения Под воздействием высокой температуры, под воздействием | 26. Эмиссионная спектроскопия (спектрофотометрия) 26.1. Фотометрия пламени 26.2. Флюориметрия (измерение 26.3. Лазерная спектроскопия 26.4. Рентгеновская флюориметрия |
Ядерные свойства Радиоактивность | 27.1. Нейтронный активационный анализ 27.2. Радиоиндикаторный анализ 2 7.3. Метод изотопного разведения 27.4. 27.4.1. Радиоиммунологический анализ 27.4.2. Конкурентное связывание | ||
Химические свойства Скорость химических реакций | 28.1. Кинетические методы |
Библиография: Асатиани В. С. Биохимическая фотометрия, М., 1957, библиогр.; он же, Новые методы биохимической фотометрии, М., 1965, библиогр.; Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, М., 1969; Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований, под ред. В. В. Меньшикова, М., 1973; Юинг Г. В. Инструментальные методы химического анализа, пер. с англ., М., 1960; Arbeits-methoden der inneren Medizin und ihr verwandter Gebiete, hrsg. v. R. Emmrich, Bd 5, Lfg 1, Jena, 1969; Automation in analytical chemistry, В. a. o., 1972; Henry R. J. Clinical chemistry, N. Y., 1964, bibliogr.; Homolka J. Klinicke biochemicke vysetfovaci metody, Praha, 1971, bibliogr.; Rehfeld N. u. Reichelt D. Analytische und praparative Methoden der klinischen Biochemie, B.,1972; Richterich R. Klinische Chemie, Baseluv a., 1971.
B. B. Меньшиков.