ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гистологические методы исследования (греч. histos столб, ткань + logos учение) — методы, применяемые для изучения строения и функций клеток и тканей растительных и животных организмов в норме, патологии и в эксперименте. Более узким по сравнению с Гистологическими методами исследования является термин «гистологическая техника», к-рым обозначают комплекс методических приемов, используемых в гистологии (см.), а также в нормальной и патологической анатомии, гл. обр. при изготовлении препаратов клеток и тканей для их последующего микроскопирования.

История

История развития Гистологических методов исследования тесно связана с совершенствованием микроскопической техники. В 17 —18 вв. под микроскопом изучали высушенные, позднее — живые объекты. С увеличением разрешающей способности микроскопов появилась возможность изучения мелких деталей клеток и тканей. Это потребовало изготовления более тонких, пропускающих достаточное количество света препаратов, для чего использовали различные приемы раздавливания, мацерации, расщепления тканей. Затем стали изготовлять срезы тканей, сначала от руки бритвой и лишь с 70-х гг. 18 в. с помощью специальных приспособлений — микротомов. Только в 19 в. были разработаны основные приемы изготовления постоянных гистологических препаратов (пригодных для многократного использования в течение длительного времени): фиксация, пропитывание тканей в средах, позволяющих изготавливать тонкие срезы на микротоме, окраска и заключение срезов в различные среды.

В первой половине 19 в. чешский физиолог и гистолог Я. Пуркинье применил с помощью специальных методов заливки уплотнение исследуемых тканей, ввел в гистологическую технику бальзам, просветление тканей в скипидаре и оливковом масле, окраску препаратов индиго и др. В 1842 г. Ганновер (A. Hannover) предложил в качестве фиксатора хромовую к-ту, в 1844 г. Майер (С. Mayer) сделал попытки микрофотографирования. В 1851 г. был применен кармин для окраски, в 1860 г. — серебрение тканей (Ф. Реклингхаузен). С появлением первых теоретических работ о механизмах фиксации и окраски [Витт (О. Witt), 1890; П. Эрлих, 1891] гистологических объектов техника гистол, исследований стала быстро развиваться.

В развитии гистологической техники важная роль принадлежит отечественным исследователям. В 1782 г. А. М. Шумлянский применил очень тонкие методы инъекции красящих р-ров для изучения кровеносных сосудов и мочевых канальцев почек.

А. И. Бабухин внес ряд усовершенствований в конструкцию микроскопа и микротома. К. А. Арнштейн, А. С. Догель, О. Е. Смирнов усовершенствовали метод окраски нервных элементов метиленовым синим (см. Догеля метод).

Пути микроскопического исследования клеток и тканей в зависимости от их состояния

Существуют два основных пути микроскопического исследования клеток и тканей в зависимости от их состояния:

1) исследование живых (переживающих) клеток и тканей;

2) исследование неживых клеток и тканей, сохраняющих в той или иной мере морфологические особенности и химическую структуру, присущую данному виду тканей. Во втором случае исследование начинается с выбора способа фиксации, затем следует заливка препаратов и приготовление срезов, окрашивание и заключение препаратов в среды.

Исследование живых или переживающих объектов (витальное и суправитальное) дает возможность наблюдать физиол, процессы в клетках и тканях, исследовать прижизненное их строение. Витальным наблюдением принято называть исследование клеток и тканей в живом организме, суправитальным — исследование живых клеток и тканей, выделенных из организма непосредственно перед исследованием и помещенных в соответствующие условия наблюдения. Прижизненные наблюдения можно проводить на клетках, свободно взвешенных в жидкой среде или выделенных из фрагментов тканей (простейшие, клетки крови, эпителиальные клетки соскобов слизистых оболочек и т. п.). Большие возможности для прижизненного наблюдения клеток и тканей дает метод культуры клеток и тканей (см.). При этом извлеченные из организма кусочки тканей помещают в специальные питательные среды, где клетки растут, размножаются или нек-рое время находятся в состоянии «переживания». С помощью этого метода визуальным путем или способом микрокиносъемки (см.) анализируют свойства исследуемых тканей, их способность к пролиферации (см.), автономному росту (см.), чувствительность к различным факторам и пр. Клетки помещают в капле физиол. р-ра или среды, в к-рой они культивируются, на предметное стекло (обычный размер 76 X 26 мм, толщина 1—2 мм), накрывают покровным стеклом (обычный размер 18 X 22 мм, толщина 0,15—0,20 мм) и изучают под микроскопом. Для предотвращения охлаждения и высыхания препаратов используют специальные приспособления (камеры с подогревом и заданной влажностью, нагревательные столики и т. п.). Простейшим приемом, предотвращающим высыхание препаратов, может служить смазывание краев покровного стекла растопленным парафином, вазелином и т. п.

Для изучения процессов образования антител, продукции гормонов, кроветворения, злокачественного роста и др. нередко применяют культивирование ‘ клеток в диффузионных камерах, стенки которых сделаны из миллипорных фильтров, пропускающих макромолекулы, но не пропускающих клетки. Такие камеры имплантируют в различные ткани организма, наблюдая изменения находящихся внутри камеры клеток под влиянием гуморальных факторов организма или веществ, введенных в камеру одновременно с клетками.

Объектом прижизненного наблюдения могут служить и тонкие, пропускающие свет тканевые пленки (брыжейка, плавательные перепонки и т. п.). Выделенную брыжейку животных, напр., можно наблюдать под микроскопом, не нарушая ее нервных и сосудистых связей с организмом. Помещая органы во влажные прозрачные камеры, можно наблюдать многие микрофизиологические процессы в ряде органов лабораторных животных. Так, напр., у крысы удалось наблюдать [Блум и Фоситт (W. Bloom, D. Fawcett), 1968] процесс овуляции и перемещения яйца в яйцевод. Методы выведения органов и тканей во влажные прозрачные камеры без нарушения связей с организмом могут использоваться лишь в острых опытах. Для продолжительных, повторяющихся наблюдений используют различные модификации предложенного Сэндисоном (J. С. Sandison, 1924) так наз. метода окошечек. При этом сквозное отверстие, сделанное в ухе кролика (или в складке кожи), с обеих сторон плотно закрывают тонкими стеклянными (или иными прозрачными) пластинками. В пространство между пластинками прорастает окружающая соединительная ткань с сосудами, что можно наблюдать, помещая «окошечко» под микроскоп. С помощью этого метода были сделаны важные наблюдения над развитием и функцией мелких тканевых сосудов и капилляров, поведением трансплантатов различных органов и т. д. Естественной прозрачной средой для прижизненных микроскопических наблюдений за теми или иными тканями может служить передняя камера глаза животных, в к-рую имплантируют изучаемую ткань. Так, в передней камере глаза удалось наблюдать первые стадии развития оплодотворенного яйца мыши, циклические изменения в кусочке трансплантированного эндометрия обезьяны (Блум и Фоситт, 1968), реактивные изменения имплантатов скелетной мышечной ткани и т. д.

Важное место среди приемов исследования живых клеток и тканей занимают методы микрургии (см.), т. е. совокупность методических приемов, дающих возможность производить разнообразные операции над помещенными в питательную среду очень мелкими и микроскопическими объектами (простейшими, клетками или комплексами клеток многоклеточных животных, яйцами иглокожих, земноводных, зародышами, внутриклеточными структурами и т. п.). В зависимости От размеров объекта операции производят вручную или с помощью специальных микроманипуляторов (см. ниже, раздел «Аппараты для гистологических исследований»). С их помощью можно производить пересадки ядер и ядрышек, введение в изолированные клетки различных веществ, подведение к клеточным мембранам микроэлектродов и т. д. Для локального разрушения микроструктур клеток, напр, ядрышек, используют сфокусированный пучок ультрафиолетовых лучей («лучевой микроукол») — прием, впервые предложенный С. С. Чахотиным в 1912 г. Использование методов прижизненных наблюдений ограничивается большими техническими трудностями, связанными со свойствами тканей (непрозрачность, оптическая однородность и т. д.), с повреждающими воздействиями освещения (особенно ультрафиолетовыми лучами и др.), токсическим действием красителей и т. п. Вследствие этого при исследовании живых и переживающих объектов , следует особенно тщательно подбирать специальные методы микроскопического исследования в каждом отдельном случае. Для витального исследования могут быть применены следующие методы микроскопии.

1. Микроскопия в темном поле (см. Темнопольная микроскопия) основана на явлении рассеивания света на границе двух объектов с разными показателями преломления (напр., ядро и цитоплазма). Темнопольный микроскоп отличается от обычного только специальным конденсором, приспособленным для бокового освещения объекта. Т. о., прямой свет в объектив не попадает, а объект, освещенный рассеянным светом, кажется светлым на темном фоне. Так, напр., в живой клетке ядрышко, ядерная мембрана, митохондрии, жировые капли и другие включения будут светиться на темном фоне неструктурированной цитоплазмы. Метод находит применение в экспериментальной микробиологии, лабораторной диагностике, в частности для обнаружения бледных трепонем, и др.

2. Фазово-контрастная микроскопия (см.) и интерференционная микроскопия основаны на свойстве биол, структур, прозрачных для видимого света, изменять фазу проходящих через них лучей. Поскольку в разных участках объекта, отличающихся показателем преломления и толщиной, эти изменения неодинаковы, биол, структуры становятся видимыми. Фазово-контрастную и интерференционную микроскопию живых клеток и тканей, особенно физиологических процессов клеток культуры тканей, часто сочетают с замедленной (цейтраферной) или с ускоренной микро-киносъемкой, с помощью к-рой можно не только зафиксировать эти процессы, но и представить их в динамике. Интерференционную микроскопию используют также для получения количественных данных о сухой массе, показателях преломления объектов и их толщине. Разновидностью фазово-контрастного микроскопирования является аноптральная микроскопия.

3. Поляризационная микроскопия основана на свойстве анизотропии (двойного лучепреломления) структур в клетках и тканях и применяется гл. обр. для выявления и идентификации некоторых кристаллических веществ и липидов, а также поперечно-полосатых мышц, коллагена, миелина и т. д.

4. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия (см. Люминесцентная микроскопия), основанная на регистрации флюоресцирующих веществ, дает возможность наблюдать клетки и ткани при освещении (возбуждении) ультрафиолетовыми или сине-фиолетовыми лучами. Люминесцентный микроскоп со стеклянной оптикой позволяет наблюдать флюоресценцию в видимой части спектра, ультрафиолетовый флюоресцентный микроскоп с кварцевой оптикой используется для изучения невидимой ультрафиолетовой флюоресценции путем ее фотографической или фотоэлектрической регистрации. С помощью люминесцентных микроскопов можно наблюдать собственную флюоресценцию содержащихся в тканях веществ, напр, витаминов А, B2, некоторых пигментов. В ультрафиолетовой области флюоресцируют, напр., содержащие триптофан белки. Наибольшее распространение, однако, получило использование специальных флюоресцентных красителей (см. Флюорохромы). Флюорохромы применяют в небольших концентрациях (1 : 10 000, 1 : 100 000), что позволяет широко использовать их для прижизненных наблюдений клеток и тканей. Интенсивность и спектры флюоресценции могут быть измерены (микрофлюорометрия), т. е. может быть получена и количественная, и качественная характеристика флюоресцирующих в клетке веществ. Флюоресцентные микроскопические методы широко используются не только для прижизненных наблюдений; они нашли применение в гистохимии, в иммуноморфологии (метод флюоресцирующих антител Кунса (см. Иммунофлюоресценция). Большие возможности для прижизненных наблюдений дает метод контактной флюоресцентной микроскопии (E. М. Брумберг, 1964), позволяющий получать изображения с поверхности органов и тканей. При этом используются специальные объективы, выполняющие одновременно роль опак-иллюминатора и конденсора.

5. Ультрафиолетовая микроскопия основана на абсорбции ультрафиолетовых лучей хим. структурами клеток (белки, нуклеиновые к-ты). Этот метод применим для прижизненных наблюдений, однако наибольшее распространение он нашел в количественной цито- и гистохимии — метод абсорбционной цитоспектрофотометрии (см. Цитофотометрия).

Способом улучшения условий микроскопического наблюдения над живыми объектами является прижизненное окрашивание их специальными красителями (см. Витальная окраска), позволяющее изучить детали строения микроскопических объектов и исследовать некоторые их физиологические свойства.

Несмотря на наличие многочисленных методов витальной микроскопии и на их большое значение, наиболее полную картину строения клеток и тканей можно получить при параллельном изучении живых и фиксированных объектов. Исследование фиксированных объектов дает возможность изучать структуру клеток и тканей неживых объектов.

Фиксация — сохранение структуры клеток тканей и микроорганизмов путем быстрого воздействия на них хим. или физ. агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений; привнесение артефактов при этом минимальное. Некоторые методы фиксации (см.) позволяют в известной степени сохранить и хим. структуру клеток и тканей. Выбор способа фиксации зависит от задач исследования и особенностей объектов. Так, при исследовании клеточных ядер и хромосом обычно используют кислые фиксаторы. При исследовании ферментативной активности применяют ацетон (см.), формальдегид (см. Муравьиный альдегид) или глютаральдегид, вызывающие минимальную денатурацию белка и сохраняющие многие ферментные системы.

Большинство фиксаторов применяют в виде р-ров, действующих гл. обр. на белковые компоненты клеток и тканей. Входящие в состав фиксирующих смесей вещества (формальдегид, сулема и т. д.) образуют прочные связи между белковыми молекулами. Так, формальдегид реагирует с аминами, карбоксильными и индольными группами белка, в результате чего между белковыми молекулами образуются метиленовые мостики; сулема действует на сульфгидрильных, карбоксильные и аминогруппы белка, образуя ртутные мостики между белковыми молекулами. Соли хрома вызывают окисление и осаждают белки и фосфолипиды. Широкое распространение получили фиксаторы, содержащие пикриновую к-ту. Одним из лучших фиксаторов для исследования цитологических объектов является четырехокись осмия (OsO₄), часто используемая для фиксации объектов, подвергающихся электронной микроскопии (см.).

При выборе фиксирующих смесей необходимо учитывать проницаемость ткани для разного вида фиксаторов. В случае медленного проникновения фиксатора в тканях могут развиться деструктивные изменения, связанные с аутолитическим действием ферментов, аноксией и т. п. Плохо проникает в фиксируемую ткань, напр., четырехокись осмия. Поэтому в р-рах осмия фиксируют кусочки тканей толщиной не более 0,5—1,0 мм. При проведении гистохим. исследований (см. Гистохимические методы исследования) необходимо знать, как влияет та или иная фиксирующая смесь на различные хим. компоненты клеток и тканей. Так, для исследования растворимых соединений используют методы замораживания-высушивания (см. Высушивание, Лиофилизация), а также замещения в замороженном состоянии. Лиофилизации состоит в быстром замораживании ткани (обычно используют жидкий азот) и ее обезвоживании (сушке) в вакууме при t° —30—40°. При методе замещения в замороженном состоянии замороженные при температуре жидкого азота ткани затем выдерживают при t° —20—60° в реактиве, растворяющем кристаллы льда (этиловый и метиловый спирт, ацетон). Оба названных метода позволяют сохранить хим. состав клеток и тканей практически неизмененным.

По окончании фиксации кусочки обычно промывают в воде или спирте. Твердые компоненты, имеющиеся в ткани (кость, хитин, отложения извести и др.), размягчают воздействием к-т или с помощью постоянного электрического тока — так наз. электролитическая декальцинация (см.) и после удаления из ткани к-ты приступают к изготовлению постоянных препаратов. Для изучения фиксированных объектов применяют многочисленные методы светооптической и электронной микроскопии.

В гистологической технике использование тотальных препаратов (мазки, отпечатки, пленочные препараты и т. п.) ограничено, и обычно приходится прибегать к изготовлению срезов тканей с помощью микротомов (см. ниже). Наиболее удобным способом, обеспечивающим быстрое изготовление срезов, является замораживание кусочка ткани. Однако при этом трудно получить достаточно тонкие срезы. Метод замораживания нельзя применять при работе с очень мелкими объектами; срезы некоторых тканей и органов крошатся и при оттаивании распадаются и т. д., в связи с этим ряд объектов приходится заливать в среды.

Заливка препаратов и изготовление срезов

Чаще прибегают к заливке объекта исследования в соответствующую среду, к-рая его пропитывает и уплотняет до консистенции, пригодной для изготовления срезов. Из сред для заливки наибольшее распространение получили парафин и целлоидин. Фиксированную ткань обезвоживают и пропитывают одним из этих веществ, проводя ее через промежуточный растворитель (ксилол или толуол для парафина, спирт-эфир — для целлоидина). Примерная схема заливки в парафин следующая. Кусочек ткани обезвоживают, проводя через ряд р-ров спирта возрастающей крепости (от 40 до 100%), затем помещают в смесь 100% спирта и ксилола (1 : 1), в ксилол (две порции), в смесь ксилола с парафином (1:1, при t° 37°), в чистый парафин (две порции, при t° 55—56°). Парафин быстро охлаждают, кусочек ткани с окружающим его парафином вырезают в виде так наз. блока. При заливке в парафин и изготовлении блоков можно пользоваться специальными рамками, позволяющими регулировать размер и форму блоков. Вместо ксилола можно использовать толуол, бензол, хлороформ, а также касторовое масло. В качестве промежуточной пропитывающей среды часто «используют диоксан, а для обезвоживания — бутиловый, изобутиловый или пропиловый спирты, амилацетат и т. п. Заливка в парафин позволяет получить достаточно тонкие, пригодные для световой микроскопии срезы (от 5—8 мкм и до 1—2 мкм). При заливке в целлоидин обезвоженный в спиртах кусочек органа или ткани переносят в смесь 100% спирта и эфира (1 : 1), после чего пропитывают спиртоэфирными р-рами целлоидина возрастающей концентрации (от 2 до 8%). Затем кусочек в виде блока в деревянных или пластмассовых рамках выдерживают в парах хлороформа до затвердевания целлоидина и помещают в 70% спирт, где препарат приобретает плотность хряща и может храниться долгое время. Целлоидиновые срезы легко режутся на микротоме и хорошо окрашиваются большинством красителей, однако толщина их больше, чем у парафиновых срезов. Иногда используют прием дополнительной заливки пропитанных целлоидином кусочков в парафин (заливка в целлоидин-парафин), что позволяет соединить преимущества обоих методов. Время обезвоживания, пропитывания в промежуточных и заливочных средах подбирают для каждого конкретного исследования. Все более широкое применение находят для заливки тканей синтетические смолы (аралдит, эпон и т. д.), особенно при изготовлении срезов для электронной микроскопии. Изготовленные срезы для дальнейшей обработки обычно наклеивают на предметные стекла. Замороженные и целлоидиновые срезы можно не наклеивать на предметные стекла, а переносить из одного р-ра в другой с помощью препаровальной иглы и т. п. Перед наклейкой парафиновых срезов на обезжиренные, чисто вымытые предметные стекла наносят тонкий слой смеси глицерина с куриным белком (1:1) и нагревают для денатурации белка. Затем в капле дист, воды на предметном стекле расправляют парафиновые срезы, слегка их подогревая. Избыток воды удаляют и стекла со срезами высушивают при t° 37—40° в термостате. Перед окраской или исследованием препаратов в неокрашенном виде из срезов удаляют парафин путем последовательного помещения препаратов в р-ры ксилола и спиртов понижающейся концентрации (от 100 до 40%). При использовании целлоидиновых срезов, как правило, не требуется специальных процедур удаления целлоидина — срезы проводят, минуя ксилол, через ряд спиртов понижающейся концентрации (вплоть до воды) и окрашивают.

Окрашивание фиксированных гистологических (цитологических) объектов служит для выявления (контрастирования) различных структур клеток и тканей, по-разному воспринимающих те или иные красители (см.) в зависимости от физ.-хим. свойств. Результаты окраски в значительной степени зависят от предшествующей обработки объекта (фиксации, заливки и т. п.). Гистол, окраска — сложный процесс, в к-ром играют роль многие физ.-хим. факторы, связанные со свойствами как красителя, так и окрашиваемого объекта. Гистол, красители классифицируют по источникам получения (натуральные и синтетические), по хим. строению (азокрасители, хинонимидные и т. д.), по способу использования (протравные и т. п.), возможности избирательно окрашивать объект (ядерные, цитоплазматические и т. п.) и по другим свойствам. По наиболее распространенной классификации красители подразделяют на основные, кислые, нейтральные и индифферентные. Основные красители представляют собой красящие основания или чаще их соли (метиленовый синий, толуидиновый синий, азуры, тионин, а также гематоксилин, бисмарк коричневый и др.). Окрашиваемые ими структуры называют базофильными (см. Базофилия). Интенсивность базофильной окраски зависит от числа кислотных групп, способных реагировать с красителем. Кислые (кислотные) красители — это красящие к-ты или их соли (пикриновая к-та, эозин, эритрозин, конгорот, лихтгрюн, оранж и т. д.). Окрашиваемые ими структуры называют ацидофильными (см. Ацидофилия), а также оксифильными или эозинофильными. К нейтральным красителям относятся смеси, содержащие как основные, так и кислые красящие компоненты, напр, смесь Романовского— Гимзы (см. Романовского-Гимзы метод) и др. Наконец, красящие свойства индифферентных красителей связаны с их способностью растворяться в определенных веществах. Так, напр., судан III или шарлах-рот хорошо растворяются только в жирах и вследствие этого избирательно окрашивают их в красно-оранжевый цвет.

Способы (механизмы) окрашивания гистологических структур весьма многообразны. Существующие теории (химическая, электроколлоидальная, физико-химическая, обменной адсорбции) касаются какого-то одного из механизмов окрашивания, но не охватывают всего многообразия связывания красителей со структурами клеток и тканей.

От окраски в собственном смысле слова отличают импрегнацию (см.) — специальный метод выявления структур клеток и тканей, основанный на различной их способности удерживать или восстанавливать соли тяжелых металлов (напр., серебра, свинца, осмия, золота).

Заключение препаратов в среды

Изготовление гистологических препаратов обычно заканчивается заключением их в среды, обеспечивающие сохранность структур объекта, его окраски и прозрачности. Наиболее часто для этой цели применяют канадский бальзам (см.) — особый вид смолы, растворимый в ксилоле, толуоле и бензоле. Хорошо промытые после окраски или фиксации препараты обезвоживают в спиртах восходящей крепости (до 100%), просветляют в смеси кристаллической карболовой к-ты (1 часть) и ксилола (3 части) и помещают в две порции чистого ксилола. Затем на препарат наносят каплю р-ра канадского бальзама (на ксилоле, толуоле или бензоле и др.) и покрывают покровным стеклом. После высыхания растворителя бальзам затвердевает, и препарат можно многократно использовать для микроскопирования. Существует много заменителей канадского бальзама (пихтовый бальзам, даммаровая смола, цедакс, полистирол и т. д.). В случаях, когда препарат нельзя приводить в контакт с ксилолом, спиртом и другими реактивами, растворяющими краситель или окрашиваемое вещество (напр., жиры) , используют водорастворимые среды (глицерин, желатину или их смеси). При применении плохо затвердевающих заключающих сред (напр., глицерина) края покровного стекла обычно окантовывают расплавленным парафином, менделеевской замазкой и т. п.

Специальные методы исследования

Из методов, применимых обычно к фиксированным клеткам и тканям или их компонентам, следует упомянуть гисторентгенографию (см. Микрорентгенография), рентгеноструктурный анализ (см.), автогисторадиографию (см. Авторадиография). Гисторентгенография основана на исследовании поглощения рентгеновских лучей структурами микрообъектов; напр., можно получить количественные данные о содержании кальция в различных участках кости и т. п. Рентгеноструктурный анализ (метод дифракции рентгеновских лучей) нашел широкое применение в исследовании органических кристаллов. В частности, с помощью этого метода изучена молекулярная структура коллагена, гемоглобина, ДНК, миоглобина и пр. Автогисторадиография — это метод регистрации радиоактивного распада в тканевых, клеточных структурах фотографическим способом. Метод широко используют в исследованиях клеточного метаболизма, а также как прием изотопной маркировки клеток при изучении их дифференцировки, возможных трансформаций и т. д.

В ряде гистологических исследований применяют макро-, микроскопические методы, предназначенные для изучения структур, находящихся на грани макроскопических и микроскопических величин. В таких исследованиях обычно используют бинокулярный (стереоскопический) микроскоп (лупу). Примером макромикроскопических методов может служить микротрахископия, разработанная М. А. Бароном (1949). Кусочки органов и тканей (обычно размером 1,5 X 1,5 см и толщиной не менее 3—4 мм) после фиксации и окраски разрезают параллельно поверхности на две части, так что препараты толщиной 1,5—2,0 мм оказываются окрашенными лишь с одной стороны. Полученные пластинки наклеивают неокрашенной стороной на целлулоид и просветляют в растворах глицерина и уксуснокислого калия возрастающих концентраций. Препарат заключают в прозрачную среду (глицерин, канадский бальзам и др.), помещают на вогнутое сферическое зеркало и рассматривают в бинокулярный микроскоп (лупу) при падающем и боковом (проходящем) свете. Метод позволяет изучать трехмерную топографию структур органов и тканей. При использовании соответствующих увеличений (объективов) удается наблюдать и микроскопические структуры — такие, как ядра клеток и даже ядрышки.

Гистологические методы исследования постоянно совершенствуются, появляются новые методы, основанные на использовании достижений оптики, физики, химии, молекулярной биологии и др. Широко используются методы гистохимии; электронная микроскопия позволяет исследовать все более мелкие структуры клеток. Совершенствуются также методы непосредственного наблюдения живых клеток и тканей, их культивирования, микрургические приемы. Постоянно развиваются и методы объективной регистрации микроскопических наблюдений, такие, как микрофотография, цейтраферная микрокиносъёмка.

Методические вопросы гистологии и цитологии освещаются во многих отечественных («Архив анатомии, гистологии и эмбриологии», «Архив патологии», «Лабораторное дело», «Онтогенез», «Цитология» и др.) и зарубежных [American J. Anatomy; Anatomical Record, J. Anatomy (London), J. Cell Biology; J. Histochemistry and Cytochemistry и др.] журналах.

Аппараты для гистологических исследований

В целях подготовки материала для гистологических работ и исследования препаратов применяют микроскопы (см.), микротомы, автоматизированные аппараты для гистол, обработки тканей и окраски препаратов, аппараты для лиофильной сушки препаратов, микроманипуляторы, термостаты (см.), нагревательные столики и устройства для автоматизации анализа морфологических структур.

Микротом предназначен для производства тонких срезов, пригодных для микроскопических исследований; он состоит из основания, приводного механизма, механизма микроподачи, объектодержателя, ножедержателя с ножом. Получение среза осуществляется при движении ножа или объекта в одном направлении, а при обратном движении срабатывает механизм подъема объекта на заданную величину, обеспечивая необходимую толщину среза в последующем цикле. Используемые микротомы можно отнести к двум типам. 1. Микротомы, в которых объект укреплен неподвижно в держателе, а нож, производящий срезы, подвижен. Существуют конструкции, в которых нож движется по горизонтальным или наклонным направляющим (санные и радиальные микротомы, рис. 1 и 4). 2. Микротомы, в которых объект при помощи специального механизма движется по вертикали или горизонтали и надвигается на лезвие укрепленного неподвижного ножа, с каждым срезом смещаясь в сторону на заданную величину (ротационные микротомы, рис. 2 и 3).

Для приготовления срезов с объектов, залитых в парафин, целлоидин, используют радиальный, ротационный (рис. 2) или санный микротомы.

Для получения срезов животной или растительной ткани в замороженном состоянии используется замораживающий микротом (рис. 4), в к-ром объект замораживается жидкой углекислотой, подводимой от баллона к столику микротома гибким шлангом в металлической оплетке, выдерживающим высокое давление. К микротомам также придаются отдельно замораживающие столики (рис. 5), на которых объект замораживается электрическим током, проходящим через полупроводниковые элементы, вмонтированные в столик.

Микротом для резки объектов, не подвергнутых декальцинации (рис. 3), имеет также замораживающее устройство; он предназначен для производства срезов с костей. Для сохранения среза в замороженном состоянии после снятия его с ножа используют микрокриостат, который представляет собой небольшую холодильную камеру, прикрепленную к замораживающему микротому, в к-рой при помощи жидкой углекислоты можно регулировать температуру от 0 до —70°. К приспособлениям, обеспечивающим качественное приготовление срезов на замораживающем микротоме, относятся различные криостаты с регулируемым охлаждением микротомного ножа. В нижней части тела ножа находится клапан, соединяющий две камеры, в которых образуется сухой лед из углекислоты. Между телом ножа, изготовленным из меди, и режущей стальной пластинкой вмонтирован датчик температуры (термопара, термистор), при помощи к-рого осуществляется контроль за температурой ножа.

Для получения срезов свежезамороженной ткани при экспресс-биопсии, а также для гистохимических исследований (изучения ферментных, антигенных и других белковых систем тканей) используют микротом-криостат (рис. 6), который представляет собой термоизоляционную камеру с микротомом и системой охлаждения.

Камера имеет двойные стенки, между к-рыми заложен теплоизоляционный материал, в дверках камеры — смотровое стекло. На передней стенке под углом расположены регулируемые по величине отверстия для рук, закрытые диафрагмами. В верхней части камеры находится испаритель системы охлаждения, на специальном столике укреплен микротом, в задней стенке камеры имеется люк для доступа к терморегулирующему вентилю, расположенному между внутренней и наружной облицовкой камеры. В камеру помещают влагопоглотитель. Система охлаждения состоит из холодильного агрегата, устройства автоматического регулирования, испарителя и соединительных трубопроводов. Холодильный агрегат вмонтирован в основание аппарата, там же расположена и система регулирования температуры. Клавиши включения аппарата в работу и освещения совместно с рукояткой регулирования температуры вынесены в нишу передней стенки основания. Шкала термореле расположена слева в окне боковой стенки основания аппарата. Микротом-криостат позволяет получать гистол, срезы нефиксированной ткани.

Все манипуляции с кусочком ткани производятся в условиях охлаждения в камере аппарата.

Для заточки микротомных ножей существует ряд приспособлений и специальных станков. Наиболее широко применяемый станок ЗМН-2 (рис. 7) обеспечивает быструю (в течение 5—7 мин.) высококачественную заточку микротомных ножей длиной от 180 до 500 мм. Угол заточки ножей от 20 до 30°.

Для приготовления сверхтонких срезов, необходимых для электронно-микроскопических исследований, применяют ультрамикротомы (рис. 8), где выполнение всех операций приготовления среза препарата и внесение его в поле микроскопа полностью автоматизировано. Резание во всех ультрамикротомах осуществляется посредством перемещения стержня с исследуемым образцом относительно неподвижного ножа. Для равномерной подачи образца к ножу используют либо термическое расширение стержня, на к-ром закреплен образец, либо механическое. Изменяя число срезов в минуту и скорость подачи объекта к ножу, можно получать срезы любой толщины. В ультрамикротомах с качающейся системой стержень с образцом колеблется в вертикальной плоскости, во время холостого хода предусматривается либо отклонение ножа, либо отведение назад стержня с образцом. Ультрамикротомы УМТ-2 обеспечивают получение срезов толщиной от 15 до 90 нм; УМТ-5 — от 5 до 100 нм.

Для автоматизации гистол, обработки тканей, окраски срезов разработаны полуавтоматы «Аутотехникон» (США), «Гистохроматор» (СССР) (рис. 9). Гистохроматоры АТ-4 имеют программное устройство и обеспечивают автоматизацию производства импрегнации, окраски, фиксации, промывки, уплотнения, обезвоживания в спиртах, пропитывания и заливки в парафин и другие среды срезов или кусочков тканей, декальцинацию, а также обработку срезов, заключенных на предметных стеклах, и другие приемы обработки гистол, материалов. Аппарат состоит из собственно гистохроматора и шкафа-термостата. Основные его части: карусель с секторами-столиками и сосудами для реактивов, механизм привода карусели и качания пористого сосуда, автоматическое устройство с программным управлением и пультом. Внутри корпуса карусели размещены механизмы и электрическая часть гистохроматора, на лицевой стороне — панель пульта управления, а на верхней панели корпуса смонтированы карусель, колодка для подключения к электрической сети, контрольный нагреватель с терморегулятором и сливной штуцер. Карусель имеет 16 съемных секторов — столиков для сосудов с реактивами. В столиках предусмотрены гнезда для бачков, в которых промываются препараты, а также подстаканники.

На пульте управления размещены табло счетчика времени, панель блока программы, ручки управления, кнопки и тумблеры (для включения счетчика времени, промывки, подсвета препаратов, поворота карусели с одновременным переключением программы, переключения работы гистохроматора на автоматическую или ручную). Обслуживание автомата заключается в подготовке реактивов и введении программы, закодированной на перфорированной ленте.

Для окрашивания гистол, препаратов на предметных стеклах имеются также многопозиционные автоматы, которые обеспечивают окрашивание по специальным режимам (быстрое, медленное).

Приготовление лиофилизированных материалов для гистологических исследований осуществляется в различных аппаратах для лиофилизации. Такие устройства имеют системы для создания глубокого вакуума. Ткань замораживают при помощи жидкого хладагента (углекислота, азот) при t° —9.0, —160°, а затем высушивают в вакууме и заливают парафином.

Для работы с микроскопическими препаратами используют микроманипуляторы — механические приспособления для работы под микроскопом. Оператор, используя микроманипулятор, который позволяет совершать точные микродвижения рабочими органами (тонкие иглы из металла и стекла, пипетки, электроды), осуществляет весьма тонкие манипуляции с клетками и другими микроскопически малыми объектами.

При ряде исследований, напр, длительных наблюдениях над клетками и тканями, для изучения культур тканей, различных исследований с включением температурного фактора, помимо термостатов, используют нагревательные столики, которые легко монтируются на предметном столике микроскопа. Удобен нагревательный столик с автоматическим терморегулятором, позволяющим поддерживать температуру от 20 до 60°. Проводятся исследования в направлении создания машинного анализатора морфол, структур по их характеристикам: форме, плотности окраски, интенсивности флюоресценции и др. Для реализации метода оптико-структурного анализа морфол, структур разработана установка «Протва-2» (рис. 10).

См. также Микроскопические методы исследования.

Библиография: Брумберг Е.М. и Барский И. Я. Контактный флуоресцентный микроскоп для медицинских исследований, Арх. патол., т. 26, № 7, с. 59, 1964, библиогр.; Виксне З.А. и Юсковец О. В. Устанавливаемая на замораживающем микротоме холодильная камера-микрокриостат, там же, т. 31, № 7, с. 79, 1969; Димов Г. Криостат с регулируемым охлаждением микротомного ножа, Арх. анат., гистол, и эмбриол., т. 53, № 11, с. 100, 1967; Епифанова О. И. и Терских В. В. Метод радиоавтографии в изучении клеточных циклов, М., 1969, библиогр.; Зеленин А. В. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот, М., 1967, библиогр.; Каминер Л. Б., Бабаджанян Д. П. и Хруст Ю. Р. Автоматический анализ микрообъектов, основанный на их флуоресценции, в кн.: Машинный анализ микроскопических объектов, под ред. Г. М. Франка, с. 49, М., 1968, библиогр.; Лилли Р. Д. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., М., 1969, библиогр.; Методы цитологического анализа, пер. с англ., под ред. А. Л. Шабадаша, М., 1957; Пирс Э. Гистохимия, пер. с англ., М., 1962; Принципы и методы гистоцитохимического анализа в патологии, под ред. А. П. Авцына и др., Л., 1971; Роджерс Э.У. Авторадиография, пер. с англ., М., 1972; Ромейс Б. Микроскопическая техника, пер. с нем., М., 1954, библиогр.; Роскин Г. И. и Левинсон Л. Б. Микроскопическая техника, М., 1957, библиогр.; Терлецкий В. А. и Середа Г. С. Микротом-криостат, Мед. техн., ^N6 1, с. 53, 1971; AmlacherE. Autoradiographie in Histologie und Zytologie, Lpz., 1974, Bibliogr.; Bloom W. a. Fawcett D. W. A textbook of histology, Philadelphia a. o., 1968.

Я. E. Хесин, H. Г. Хрущов; В. И. Белькевич, 3. С. Ключарева, Л. Ф. Коблов (техн.).