ГРАЦИА МЕТОД

ГРАЦИА МЕТОД (A. Gratia, бельг. микробиолог; син.: метод агаровых слоев, двухслойный метод) — способ титрования бактериофага путем подсчета количества негативных колоний, образовавшихся на плотной питательной среде. Предложен в 1936 г.

Метод основан на представлении, что негативная колония возникает в результате развития отдельной корпускулы фага. Т. о., количество негативных колоний, образовавшихся после высева определенного объема титруемого фага, соответствует количеству корпускул бактериофага (см.), содержащихся в этом объеме. Установлена количественная корреляция между числом видимых в электронный микроскоп частичек и количеством негативных колоний, обнаруживаемых при титровании фага по Г. м.

Г. м. объединяет два ранее применявшихся способа титрования бактериофага: 1) глубинный агаровый, при к-ром определенный объем титруемого фага смешивают с чувствительной культурой, а затем к смеси добавляют расплавленный питательный агар, после чего смесь выливают в чашку Петри (недостаток способа— распределение фага по всей толщине агара, что затрудняет подсчет образовавшихся негативных колоний); 2) метод поверхностного нанесения: приготовленную из чувствительной культуры и определенного объема титруемого фага смесь наносят петлей или пастеровской пипеткой на поверхность питательного агара в чашке Петри (см. Петри чашки). Недостаток второго способа заключается в том, что на поверхность агара можно нанести 0,1 мл смеси— количество, недостаточное для точных определений; посевы негомогенные, распределение фага неравномерное.

Г. м. дает возможность исследовать достаточно большие объемы фага (0,5—1 мл), добиться равномерного распределения его в поверхностном слое среды, что облегчает подсчет количества негативных колоний.

Негативные колонии бактериофага, оттитрованного по методу Грациа.

Для проведения титрования необходимо иметь следующие питательные среды: 1,5% мясо-пептонный агар, 0,7% мясо-пептонный агар, физиол, р-р поваренной соли. Накануне опыта 1,5% мясо-пептонный агар или другую питательную среду разливают по чашкам Петри в количестве 25—30 мл. Чашки, прикрытые стерильными бумажками, подсушивают в течение нескольких часов в термостате или боксе при ультрафиолетовом облучении. При работе с фагами кишечной группы рекомендуется к 1,5% агару добавить генциан-виолет (0,1 мл 0,4% спиртового р-ра краски на 1 л агара); это предохранит среду от прорастания флорой воздуха. В день опыта 0,7% агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляют и помещают в водяную баню при t° 46°. Затем титруемый фаг десятикратно стерильно разводят в пробирках бульоном или другой питательной средой так же, как при титровании по методу Аппельмана (см. Аппельмана метод). К 2,5 мл расплавленного 0,7% агара добавляют 1 мл фага соответствующего разведения и 0,1 мл смыва агаровой культуры, чувствительной к фагу. Смыв готовят с косяка 5 мл бульона или физиол. р-ра поваренной соли. Содержимое пробирки быстро перемешивают, вращая ее между ладонями, и выливают в чашку Петри с подсушенным 1,5% агаром. Слегка покачивая чашку, добиваются равномерного распределения 0,7% агара по поверхности 1,5% агара. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности стола до застывания верхнего слоя агара, перевертывают и помещают в термостат при t° 37° на 4,5 час., а затем оставляют их при комнатной температуре на 24— 36 час. В результате в верхнем слое агара образуются прозрачные негативные колонии на непрозрачном фоне бактериального роста (рис.).

При проведении титрования следует избегать длительного хранения 0,7% агара при t° 46 °, т. к. примерно через 1 час он начинает густеть, превращаясь в гель, что снижает количество выявляемых колоний. Титр фага, определяемый по Г. м., выражается количеством корпускул фага, способных образовывать негативные колонии в 1 мл фага. Так, напр., если при высеве 1 мл фага, разведенного до 10-7, на чашке образовалось 35 колоний, то титр такого фага равен 3,5 X 108 корпускул/мл.

Библиография Gratia A. Des relations nu-m6riques entre bacteries lysogfcnes et parti-cules de bacteriophage, Ann. Inst. Pasteur, t. 57, p. 652, 1936; Methods in medical research, ed. by J. H. Comroe, v. 2, p. 7, Chicago, 1953.

Д. М. Гольдфарб.