МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И МЕДИЦИНА • Med-of-Rita

По вопросам, близким к освещаемой теме, в БМЭ опубликованы статьи Белки, Биология, Биохимия, Вакцинация, Вакцины, Ген, Генная инженерия, Генотерапия, Дезоксирибонуклеиновые кислоты, Молекулярная биология, Молекулярная генетика, Наследственные болезни, Нуклеиновые кислоты, Онкогенез, Опухоли, Полисахариды, Рекомбинация, Углеводы и др.

Молекулярная биология оформилась в самостоятельную научную дисциплину и стала бурно развиваться начиная с 50-х гг. 20 в. Формальное «начало» молекулярной биологии связывают с открытием наследственной трансформации бактерий под действием ДНК (1944) и установлением пространственной структуры молекул ДНК — знаменитой двойной спирали (1953). В нашей стране в становление молекулярной биологии крупный вклад внесли Н. К. Кольцов, А. Н. Белозерский, В. А. Эпгелъгардт, JI. А. Зилъбер, Р. Б. Хесин-Лурье.

Конечной целью молекулярной биологии служит понимание основных явлений, свойств и признаков жизни (размножения, движения, передачи наследственных свойств, изменчивости, эволюции, психической деятельности и др.), исходя из физических и химических свойств молекул, слагающих живые организмы, в первую очередь молекул биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов). Решая основные проблемы общей биологии, молекулярная биология использует широкий арсенал идей и методов не только этой науки, но также физики и химии. Она теснейшим образом смыкается с биохимией, биоорганической химией, генетикой, вирусологией, микробиологией, биологией клеток, иммунологией, онкологией, биологией развития и др. Основной методологический принцип молекулярной биологии может быть сформулирован следующим образом: от изучения физико-химическими методами свойств отдельных молекул и их комплексов к изучению надмолекулярных структур и далее клетки и организма в целом.

Стремясь к познанию основных явлений жизни на молекулярном уровне, молекулярная биология постоянно и неизбежно сталкивается с отклонениями от нормы и с патологией изучаемых объектов. Однако общеизвестно, что понимание природы любых болезней невозможно без знания нормы, а также причины и механизма отклонения организма от нормального функционирования. Именно поэтому молекулярная биология и медицина должны постоянно взаимодействовать между собой; это не только обогащает и расширяет возможности медицины, но ставит и перед молекулярной биологией более конкретные и более утилитарные задачи. Стало очевидным, что непосредственные, прямые контакты молекулярной биологии и медицины глубже и шире, чем это казалось еще 10 лет назад. За последние годы (1975—1986) в молекулярной биологии широкое распространение получили новые методы, к-рые радикально изменили облик этой области исследований. К таким методам относятся совокупность приемов генетической инженерии, расшифровки первичной структуры биополимеров, получения моноклональ

ных антител, метод «переноса генов» и др. Постепенно стало ясным, что дальнейший прогресс как профилактической, так и клинической медицины невозможен без использования идей и методов молекулярной биологии, особенно при изучении таких болезней, как сердечно-сосудистые, онкологические, вирусные и наследственные.

Развитие молекулярной биологии и других медикобиологических дисциплин служит предметом постоянной заботы партии и правительства нашей страны.

«Основные направления экономического и социального развития СССР на 1986—1990 годы и на период до 2000 года» предусматривают необходимость ускорения научно-технического прогресса и развития биотехнологии, физико-химической биологии, получения физиологически активных веществ, дальнейшего развития иммунологии и вирусологии, генетики, методов и средств профилактики, диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний.

Ниже будут рассмотрены нек-рые примеры того, как влияют достижения молекулярной биологии на прогресс медицины и что можно ожидать в ближайшем будущем от союза этих двух наук.

Новое поколение вакцин

Вакцинация в профилактической медицине занимает особое, главенствующее место, к-рое сохранится и в будущем. Поэтому принципиальное усовершенствование путей и методов вакцинации, ее избирательности и эффективности составляет одну из первоочередных задач медицины. Известно, что существующие вакцины несовершенны: они содержат много балластных биологически активных примесей, иммуногенность этих вакцин часто невелика, иногда в результате вакцинации возникают нежелательные побочные эффекты. Кроме того, производство вакцин классическими способами сопряжено со значительными трудовыми и материальными затратами. Выход из этого положения был найден благодаря успехам генетической инженерии. В тех случаях, когда структура белка, вызывающего иммунитет к данному возбудителю (бактерии или вирусу), известна (а в этом отношении достигнуты большие успехи), для получения вакцин можно использовать разные подходы. Во-первых, можно искусственно создать рекомбинантную молекулу ДНК, в к-рой содержится ген, кодирующий синтез требуемого белка-антигена (так наз. экспрессирующийся вектор). Если такую рекомбинантную ДНК ввести в клетки дрожжей или бактерий, где она сможет функционировать, то клетки этих микроорганизмов начнут продуцировать требуемый антиген. При условии квалифицированного выполнения генно-инженерных манипуляций этот антиген может составить половину и даже более всего белка, синтезируемого микроорганизмом. После тщательной очистки полученный антиген готов для прививок. Во-вторых, зная расположение антигенных детерминант вдоль поли-пептидных цепей молекулы белка, можно сконструировать такую рекомбинантную ДНК, в к-рой будет присут-

ствовать фрагмент гена, кодирующий синтез не всего антигенного белка, а только тех участков его молекулы, к-рые содержат наиболее активные антигенные детерминанты или даже одну из них. В-третьих, можно вообще отказаться от микробиологического синтеза антигенного белка или участков его молекулы, а, зная первичную структуру антигенных детерминант, получить иммуно-генные пептиды путем химического синтеза и затем иммобилизовать их на каком-либо носителе — индифферентном полимере — ив таком виде использовать для прививок. И, наконец, в-четвертых, можно сконструировать поливалентную синтетическую вакцину, где будут совмещены антигенные детерминанты белков, принадлежащих разным возбудителям, т. е. получить гибридный белок, способный при введении в организм вызывать иммунный ответ, защищающий от нескольких инфекций сразу.

Достижения молекулярной биологии и иммунологии привели в последние годы к созданию эффективных безопасных и недорогих вакцин, к-рые в настоящее время проходят клинические испытания. Это вакцины против ряда распространенных вирусных заболеваний (гепатита В, полиомиелита, ящура). Антигенный белок или полипептид для приготовления таких вакцин получают микробиологическим или химическим способом, очищают, а затем используют для иммунизации. Однако можно использовать и принципиально иной путь, когда нужный антиген или его детерминанта не синтезируется заранее отдельно, а образуется в том самом организме, в к-ром хотят вызвать иммунный ответ. Выяснилось, напр., что из генома вируса осповакцины можно удалить значительные участки или заменить их другими без потери вирусом жизнеспособности. Генно-инженерным путем удаляли часть генетического материала вируса, а на его место встраивали ген, кодирующий синтез того антигенного белка, к к-рому хотят получить иммунитет. Именно таким способом получена и уже применяется живая вакцина против гепатита В. На основе вируса осповакцины можно создавать вакцины и против других заболеваний, а также поливалентные вакцины. Основное преимущество вакцин на основе вируса осповакцины состоит в их дешевизне, а также в том, что безвредность вакцинации с помощью осповакцины доказана более чем вековым опытом ее применения на сотнях миллионов людей.

Преимущество получения антигенов с использованием в качестве продуцентов клеток эукариотических организмов, в т. ч. клеток млекопитающих в культуре, или путем выработки нужных антигенов в самом иммунизируемом организме, как в случае с рекомбинантными оспо-вакцинами, заключается в том, что в клетках-продуцен-тах происходит так наз. посттрансляционная модификация белков (присоединение углеводных остатков — гли-козилирование, остатка уксусной кислоты — ацетилиро-вание, остатка или остатков фосфорной кислоты — фос-форилирование и т. д. ), что весьма существенно для приобретения синтезируемыми белками полной анти-генности, т. е. абсолютного соответствия исходному антигену. Хотя микробиологический синтез белков и химический синтез пептидов дешевле и технологичнее, чем их синтез культивируемыми клетками высших организмов, будущее, по-видимому, принадлежит именно второму пути, т. к. нужная структура антигена и наиболее эффективный иммунный ответ могут быть получены только в этом случае. Это означает, что сейчас крайне актуальной задачей является развитие «эукариотической» промышленности в дополнение к успешно развивающейся микробиологической промышленности.

Будущее проблемы вакцинации видится в таких генно-инженерных конструкциях, когда в одной белковой молекуле можно будет собрать антигенные детерминанты белков, принадлежащих разным возбудителям. Эти детерминанты, обладающие сильной иммуногенностыо, способны обеспечить создание стойкого иммунитета про

тив соответствующего возбудителя. Конечно, при конструировании таких вакцин могут возникнуть определенные сложности, но нельзя не видеть, что молекулярно-биологический генно-инженерный подход революцго-низирует одну из старейших областей медицины — получение вакцин и вакцинацию.

Новые методы диагностики

Методы молекулярной биологии и генно-инженерные подходы сделали возможным получение в больших количествах тех белков и нуклеиновых кислот, к-рые .могут служить основой для создания специфических диаг-ностикумов. Создание рекомбинантных молекул ДНК, содержащих целые геномы или части геномов вирусов пли бактерий, позволяет получать в значительных количествах вирусные и бактериальные нуклеиновые кислоты, очистка к-рых не представляет больших сложностей. Такие препараты можно использовать с диагностической целью для обнаружения вирусов или бактерий (точнее — их геномов) в сыворотке крови или в тканях. Чтобы обнаружить вирусную или бактериальную нуклеиновые кислоты, достаточно получить рекомбинантные молекулы тех же самых нуклеиновых кислот, меченных радиоактивным изотопом или флюоресцирующими химическими группировками. Они связываются с нуклеиновыми кислотами, имеющими комплементарные нуклеотидные последовательности, и служат своеобразным зондом. Смешивая сыворотку крови или экстракт из исследуемой ткани с таким «зондом» и нагревая смесь, получают возможность легко обнаружить искомые нуклеиновые кислоты по радиоактивности или флюоресценции.

Описанный диагностический подход разрабатывается применительно ко многим инфекционным болезням, однако пока для этой цели чаще используют белки, полученные генно-инженерным или обычным путем. Такие белки легко иммобилизовать в ячейках специальных пластин, в к-рые затем вносят сыворотку крови обследуемых. Если в крови присутствуют антитела к определенному бактериальному или вирусному белку, их легко обнаруживают с помощью одного из современных иммуно-химических методов. Таким образом, геняо-инженериое получение белковых антигенов не только создает новую основу для производства вакцин, но и позволяет использовать эти антигены для обнаружения антител к данным белкам. Наконец, те же самые белки могут быть использованы для иммунизации и получения так наз. моноклональных антител. При слиянии in vitro опухолевой клетки и спленоцита (клетки селезенки) иммунизированного животного образуется соматическая гибридная клетка, унаследовавшая, с одной стороны, способность к неограниченному росту, а с другой стороны — способность к синтезу только одного типа антител. При размножении (клонировании) таких гибридных клеток образуется клон (гибридома), продуцирующий абсолютно идентичные антитела, получившие название моноклональных, к одной из антигенных детерминант того антигена, к-рым иммунизировали животное — донора спленоцитов. К настоящему времени получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к сотням белков, в т. ч. к белкам вирусов и бактерий. Производство таких антител весьма дешево, технологично, и поэтому они служат основой для получения десятков днагностикумов, позволяющих в сыворотке крови обнаруживать тот или иной белок-антиген, принадлежащий возбудителю заболевания.

Однако обновление диагностических методов с помощью молекулярной биологии не ограничивается только использованием нуклеиновых кислот и белков, полученных генно-инженерными методами. Бурное развитие молекулярной биологии гена и методов структурного анализа позволило создать методы молекулярной диагностики, ранее вообще невозможные. Напр., тонкие изменения структуры генов являются причиной многих наследственных болезней. Ферменты, расщепляющие ДНК в опреде-

ленных точках (рестрикционные эндонуклеазы, или рест-риктазы), позволяют обнаружить эти тонкие различия между нормальным и патологическим геном по характеру расщепления ДНК, выделенной из клеток обследуемого. Для рестрикционного анализа ДНК можно использовать ядерные клетки крови, клетки амниотической жидкости, материал, полученный при биопсии, и др. Особенно важно применять методы молекулярной диагностики в случаях, когда анамнестические данные или генетический анализ хромосом родителей позволяют предвидеть высокую вероятность рождения ребенка с наследственным заболеванием. Хотя эти методы в настоящее время нельзя считать дешевыми и широкодоступными, тем не менее несомненно, что они будут применяться в будущем в медико-генетических консультациях и центрах по охране здоровья матери и ребенка.

Как конкретно осуществляется прогнозирование в случае подозрения на возможность передачи наследственного заболевания потомству? Предварительно клонируют ген, дефект к-рого является причиной предполагаемого моногенного заболевания, и с помощью молекулярной гибридизации определяют число и расположение участков «узнавания» разных рестриктаз как в самом гене, так и вблизи него (слева и справа). При этом анализ ведется у разных индивидов, с тем чтобы установить, какие участки «узнавания» рестриктаз одинаковы у всех людей, а какие различны. Почти все рестриктазы расщепляют ДНК у разных людей строго идентично, однако обязательно находятся один-два фермента, к-рые дают неидентичную картину расщепления: либо образуется разное число фрагментов (это довольно редкий случай), либо образующиеся фрагменты оказываются разной длины, т. е. наблюдается полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, или ПДРФ (англ. RFLP — restriction fragment length polymorphism). ПДРФ является четким генетическим признаком и может служить специфическим маркером. У человека, имеющего дефект по определенному гену, ПДРФ становится одновременно маркером заболевания, детерминированного этим патологически измененным геном, а если такой же ПДРФ обнаруживают нри изучении клеток плода, то следует ожидать рождения больного ребенка. Существенно, что аномальный ПДРФ может быть не только в самом «больном» гене, но и неподалеку от него, причем в этом случае для пренатальной диагностики можно использовать любой молекулярно клонированный фрагмент ДНК этого района хромосомы. Важно, чтобы генетический дефект, локализованный в хромосоме и обусловливающий заболевание, был расположен как можно ближе к аномальному рестрикционному фрагменту, иначе при рекомбинации в ходе образования гамет генетический маркер, полиморфный по данной рест-риктазе, и поврежденный локус могут оказаться разделенными.

Существенное преимущество этого подхода к диагностированию наследственных заболеваний состоит в том, что не нужно знать, какой ген поврежден при данной болезни, т. к. аномальная длина фрагмента, образовавшегося под действием определенной рестриктазы, не является причиной болезни и служит только достоверным генетическим признаком, позволяющим ставить пренатальный диагноз и вместе с тем способствовать обнаружению дефектного гена. Этот подход уже начал использоваться при пренатальной диагностике таких наследственных болезней, как болезнь Дюшенна, хорея Гентингтона, болезнь Леша—Найхана и др.

Пренатальная диагностика гемофилии А (моногенного дефекта, сцепленного с Х-хромосомой и генетически обусловленного недостаточностью фактора VIII свертывания крови) основана на ПДРФ по участку расщепления рестриктазой Bell. Наряду с 11 фрагментами постоянной длины на З’-конце гена, кодирующего синтез фактора VIII, картируется аномальный полиморфный участок с длиной либо 879, либо 1165 пар нуклеотидов. Гемофилия

Производство ряда биологически активных веществ, используемых в медицине в качестве лекарственных средств, встречает большие трудности, связанные с малой доступностью исходного материала, крайне низким содержанием в нем выделяемого вещества или сложностью и дороговизной процедуры его выделения и очистки. Это относится к различным гормонам, нейропептидам, факторам свертывания крови, интерферону и др. В последние годы удалось успешно клонировать ряд генов, кодирующих синтез этих веществ, определить их структуру, а также сконструировать новые рекомбинантные молекулы ДНК, способные в соответствующих одноклеточных микроорганизмах (кишечная па лечка, бациллы, дрожжи) поддерживать высокий уровень синтеза белка или пептида, кодируемого нужным геном. Таким образом, возник принципиально новый путь получения биологически активных белков и пептидов, открывший не известные ранее возможности заместительной терапии многих заболеваний человека. Уже прошли или проходят клинические испытания полученные таким способом интерферон, инсулин, гормон роста и др. Путем микробиологического синтеза получены фермент урокиназа (КФ 3.4.99.26) и активатор плазминогена: белки, к-рые будут использованы для лизиса тромбов при тромбозах сосудов. Специалисты считают, что в 90-е гг. 20 в. в мире будет выпускаться не менее 20 лекарственных средств белковой природы, полученных с использованием новых биотехнологических методов. Прежде всего это будут препараты, предназначенные для борьбы с вирусными болезнями, гормональными и сосудистыми нарушениями, болезнями крови. Генно-инженерным путем удалось получить фактор некроза опухолей (TNF), к-рый обладает выраженным терапевтическим эффектом при нек-рых злокачественных опухолях у человека.

Раскрытие первичной структуры генов, кодирующих синтез сравнительно низкомолекулярных белков и полипептидов, позволяет осуществить химический или ферментативно-химический синтез гена с его последующим внедрением в соответствующую молекулу ДНК и с помощью этой сконструированной рекомбинантной ДНК получить требуемый белок или полипептид путем микробиологического синтеза. Напр., гормон кальцито-нин будет производиться, вероятно, именно таким способом.

По сравнению с традиционными методами генно-инже-нерный подход к получению ряда лекарственных средств удешевляет их получение, а готовые препараты содержат меньше примесей. Принципиальные преимущества этого заключаются в том, что появляется реальная

Новые пути получения лекарственных средств

В, связанная с дефектом гена, кодирующего синтез белкового фактора IX свертывания крови, диагностируется по ПДРФ, полученному при действии рестриктаз Xmal, Hinfl и Tagi. Семейную гиперхолестеринемию, связанную с мутацией в гене рецептора липопротеидов низкой плотности, обнаруживают по характерному>т1одиморфизму длин фрагментов расщепления этого гена рестриктазой Pvull. В гене, кодирующем синтез коллагена и дефектном при ряде наследственных болезней, выявлен ПДРФ по рестриктазе HindIII и участкам «узнавания» других рестриктаз.

Методом рестрикционного анализа ДНК можно не только диагностировать наследственные болезни, но и обнаруживать присутствие вирусов или провирусов в половых или соматических клетках, что в ряде случаев (напр., при инфицировании вирусами герпеса или гепатита В) весьма существенно.

Многие наследственные болезни, вызванные повреждением одного гена, уже картированы на хромосомах человека и могут быть точно диагностированы в пренатальном периоде. Таким образом, описанные выше методы по сути дела закладывают основы новой дисциплины — молекулярно-диагностической медицины.

возможность синтеза таких белков или полипептидов, к-рые вообще нельзя получить иным способом. Подобными полипептидами являются, напр., факторы свертывания крови, необходимые для лечения гемофилии. Кроме того, появляется возможность внесения практически любых изменений в молекулу получаемого белка или полипептида благодаря разработке методов направленного мутагенеза. Так, в полипептидных цепях можно заменять остатки одних аминокислот на остатки других аминокислот, укорачивать полипептидные цепи с одного или с обоих концов, удалять внутренние участки цепей и т. д. Фармакологическая активность белков, подвергшихся заранее спланированным структурным изменениям, может быть усилена или видоизменена, что крайне важно для преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов, устранения лекарственной аллергии и других нежелательных явлений. Несомненно, получение лекарственных средств белковой природы путем изменения генов, кодирующих их синтез, должно основываться на знании взаимосвязи между структурой белковой молекулы и ее функциями, что и является предметом молекулярной биологии.

Генетическая инженерия позволяет получать так наз. полибелки, или химерные, слитные белки, образующиеся в результате соединения двух и более генов, кодирующих их синтез. Благодаря этому появилась принципиальная возможность создания «по ли лекарств», в одной молекуле такого лекарственного вещества можно соединить, напр., два белковых гормона или два фермента, если их совместное применение с терапевтической целью целесообразно. Это не только позволит избавить больного от лишних процедур, но и снизит стоимость лекарства за счет удешевления очистки, контроля и расфасовки.

Генотерапия

Генотерапия, теоретические основы к-рой созданы молекулярной биологией и генетической инженерией, является частным случаем молекулярной медицины. Ее сущность заключается в том, что знание молекулярных основ патологии преобразуется в лечение людей через «лечение молекул».

Хотя новые пути получения относительно дешевых и чистых лекарственных препаратов крайне важны и резко увеличивают возможности медицины, мечтой врача остается не заместительная терапия при недостатке какого-либо вещества в организме, а радикальное излечение путем восполнения недостающего компонента самим организмом. Большое число наследственных болезней связано с отсутствием или подавлением синтеза того или иного белка или со снижением и даже полным отсутствием биологической активности этого белка из-за его структурного изменения в результате мутации соответствующего гена. Радикальное излечение таких больных должно состоять в замене дефектного гена полноценным или во введении в геном дополнительного полноценного гена при условии, что дефектный не будет мешать его функционированию. В этом случае сразу возникает ряд серьезных проблем: необходимо однозначно установить, дефект какого гена служит причиной заболевания; необходимо выделить и размножить методами генетической инженерии нормальный ген, предназначенный для замены дефектного гена; нормальный ген должен быть введен в такую конструкцию, где он может эффективно направлять синтез соответствующего белка в клетках человека; этот ген должен быть обеспечен таким молекулярным окружением, к-рое позволит регулировать его активность в зависимости от потребностей организма; «здоровый» ген должен быть введен таким образом, чтобы закрепиться и сохраниться в геноме, напр, при делении клеток; нормальный ген должен быть введен в достаточное количество клеток, чтобы его активность обеспечила потребности организма в целом; желательно, хотя, может быть, и не строго обязательно во всех случаях, чтобы ген функционировал именно в тех клетках или тканях, где он «работает» в нормальных организмах. Уже при современном уровне развития моле

кулярной биологии первые три требования теоретически выполнимы. Сложнее обстоит дело с остальными условиями, однако темпы развития молекулярной биологии столь стремительны, что и здесь перспектива достаточно отчетлива.

В генетической инженерии специально сконструированные молекулы ДНК, обладающие способностью независимо от деления клеток размножаться в них и содержащие в своем составе чужеродные участки ДНК (гены или их фрагменты), к-рые нужно таким образом размножить, называют векторами. Векторами чаще всего служат плазмиды микроорганизмов, вирусы бактерий (фаги) и животных. Наибольшее внимание в качестве векторов для введения нужных генов в геном клеток человека сейчас привлекают вирусы, способные внедрять свой геном в геном зараженной клетки. К ним относятся ДНК-содержащие паповавирусы (вирусы папиллом, по-лиомы, обезьяний вакуолизирующий вирус ОВ40), аденовирусы, вирусы герпеса и РНК-содержащие вирусы семейства ретровирусов. Хотя большинство этих вирусов онкогенно для клеток человека, существуют способы удаления из их геномов онкогенов и других потенциально опасных участков. Емкость генома этих вирусов достаточна для того, чтобы вмещать вместо нек-рых его частей нужный ген без потери жизнеспособности вируса. Поскольку вирусы обладают специфическим сродством к различным тканям, то можно ожидать определенного избирательного распределения вносимого гена в организме человека. Регуляция активности такого гена может быть обеспечена как регуляторными элементами самого вируса, так и внесением в вирусный геном особых регуляторных элементов, «откликающихся» на специфические сигналы. Проблема введения вектора, несущего нужный ген, в достаточное количество клеток может, вероятно, решаться разными путями. Прежде всего, введением вектора с геном в зародышевую клетку для того, чтобы все клетки будущего организма несли нужный ген (если заранее было известно, что зародыш будет дефектен по данному гену). Этот путь, как показано экспериментально, принципиально возможен, однако применительно к человеку он вряд ли будет реализован в 20 в. из-за необходимости решения больших методических и этических проблем. Можно вводить in vitro вектор с геном в стволовые кроветворные клетки, к-рые дадут начало форменным элементам крови. Этот путь кажется принципиально осуществимым в отношении таких болезней, как серповидно-клеточная анемия, талассемия и, вероятно, нек-рых других. Вероятен путь введения векторов с генами в органы, где можно обеспечить массивное заражение ими многих клеток (напр., в печень). Вероятно, при использовании активных ретровирусных векторов и особых форм их доставки к клеткам такой путь в будущем тоже может оказаться возможным.

Вполне реально, что в ближайшие годы можно будет, взяв у пациента клетки костного мозга, заражать их in vitro рекомбинантными ретровирусами, несущими нужный ген и, убедившись, что ген встроен в геном и функционирует, возвращать «исправленные» клетки в костный мозг пациента, где они будут размножаться и обеспечивать поступление в организм недостающего белка. Вероятно, первыми болезнями, к-рые будут лечить по этой схеме, станут редкие моногенные болезни, напр, болезнь Гоше.

Молекулярная природа рака

Выше говорилось, что молекулярная биология оказывает воздействие на практическую медицину через совершенствование и создание новых вакцин, диагности-кумов и лекарственных средств. Однако за период с 1955 по 1985 г. главный вклад молекулярной биологии был сделан в познание природы различных болезней, их этиологии и патогенеза. Существуют многочисленные примеры, к-рые могут иллюстрировать это положение, но мы остановимся только на проблеме природы злока-

чественных новообразований — труднейшей, по общему признанию, проблеме медицины. В этой области, пожалуй, наилучшим образом видна благотворность идей и методов молекулярной биологии для медицины, дающих новый импульс изучению болезней человека, известных с древнейших времен. В домолекулярно-биологиче-ский период изучения проблемы возникновения злокачественных опухолей высшим достижением являлась вирусогенетическая теория возникновения рака, предложенная JI. А. Зильбером. Эта теория, получившая полное экспериментальное обоснование, на многие годы определила эффективное и плодотворное развитие вирусологии и иммунологии рака, сыграла огромную роль во внедрении в сознание врачей представлений генетики, вирусологии, биохимии, приучила их к новым взглядам на природу рака.

Следующий шаг принципиальной важности в изучении проблемы возникновения злокачественных опухолей был сделан тогда, когда возникновение опухолей стали связывать с особыми генами — онкогенами, входящими в состав генетического аппарата опухолеродных вирусов. В дальнейшем на примере опухолеродных ретровирусов было показано, что их онкогены возникают из клеточных генов, получивших название «протоонкогены». Онковирусы, захватывая клеточные протоонкогены пугем рекомбинации, частично модифицируют их, делая активными и способными трансформировать клетки. Позже выяснилось, что превращение протоонкогенов в онкогены, наблюдаемое при взаимодействии ретровирусов с геномом клетки, может происходить и без участия вирусов, напр, путем точечных мутаций протоонкогенов или путем их амплификации (умножения). Учение об онкогенах занимает сейчас доминирующее положение во всех гипотезах о механизме малигнизации клеток.

Нек-рые ретровирусы не содержат онкогенов, однако способны вызывать образование опухолей. Очевидно, в этом случае молекулярный механизм малигнизации иной; напр., ретровирус прямо или опосредованно может активировать протоонкогены клетки, в другом случае вирусные гены, функционируя в клетке, могут давать эффект, похожий на действие онкогенов. Такими ретровирусами являются ретровирусы HTLV-I и HTLV-II, вызывающие лейкоз с патологической пролиферацией Т-лимфоцитов у человека, и вирус бычьего лейкоза (БЛВ).

Совсем недавно специалистам в области молекулярной биологии и вирусологам удалось раскрыть ретровирусную природу тяжелого заболевания — синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Оказалось, что вирус, вызывающий СПИД,— HTLV-III, или LAV, по нек-рым признакам похож на вирусы HTLV-I и HTLV-II, а также на БЛВ, его генетическая структура полностью расшифрована, а молекулярный механизм действия интенсивно изучается.

Методами молекулярной биологии в геноме здоровых людей нашли несколько эндогенных провирусов, отличающихся от ретровирусов животных, что заставляет предположить возможную связь этих провирусных структур с наследственными заболеваниями неизвестной природы, а также существование еще не идентифицированных вирусов, поражающих человека.

По мнению большинства современных исследователей, активация онкогенов под действием факторов физической (рентгеновское и УФ-излучение, механическое раздражение и др.), химической (эндо- и экзогенные онкогенные вещества) и биологической (вирусы) природы является необходимым условием малигнизации клеток. Действительно, у человека во всех изученных к настоящему времени опухолях разного гистологического строения и локализации, как первичных, так и метастатических, обязательно активны два и более онкогена. В нормальных тканях эти онкогены либо совершенно не активны, либо их активность во много раз ниже, чем в опухоли. Активные онкогены, выделенные из опухолей человека, способны в соответствующих условиях проникать в клетки, нахо-дящиеся в культуре, и вызывать их морфологическую трансформацию. Более того, такие клетки при введении их мышам с удаленной вилочковой железой дают начало опухоли.

Хорошо известная онкологам многоступенчатость он’ когенеза, описанная на морфологическом и клиническом уровнях, получила молекулярно-биологическое объяснение. Оказалось, что полная малигнизация клеток про^ исходит при действии не менее двух онкогенов, а дейст^ вие одного онкогена вызывает эффект, примерно эквивалентный предраковому состоянию. Предполагают также, что метастазирование и прогрессия опухолей связаны с включением дополнительных генов, среди к-рых могут бщть как онкогены, так и другие гены. Число открытых и охарактеризованных онкогенов непрерывно растет. Так, к концу 1986 г. было известно ок. 30 онкогенов.

Благодаря методам расшифровки первичной структуры нуклеиновых кислот в сочетании с методами генетической инженерии нуклеотидные последовательности большинства онкогенов были выяснены, а следовательно, стала известна и последовательность аминокислотных остатков в кодируемых ими белках. Белки — продукты онкогенов называют онкобелками. Именно появление в клетке онкобелков в результате активации онкогенов и есть молекулярное событие, с к-рого начинается превращение нормальной клетки в опухолевую. Механизм действия онкобелков нельзя считать расшифрованным, хотя в этой области работают сотни первоклассных лабораторий во всем мире, однако нек-рые гипотезы, появившиеся в последнее время в литературе, поддаются экспериментальной проверке и служат хорошей основой для дальнейшего целеустремленного изучения.

Онкобелки по их локализации в клетке делят на несколько групп: мембранные (продукты онкогенов src, ros, f es, fps, abi, f ms, ras, erbB и др.), ядерные (продукты онкогенов туе, myb, f os, р53 и др.)? цитоплазматические (продукты онкогенов mos, rei, erbA и др.)» внеклеточные (продукты онкогена sis). Уже из этого распределения становится ясным, что механизм действия онкобелков должен различаться, что подтверждают и различия в свойствах онкобелков. Напр., онкобелки — продукты онкогенов, родственных гену sre, а также онкогенов егЬВ и f ms являются ферментами протеинкиназами, катализирующими перенос у-фосфатного остатка с молекулы АТФ на остатки тирозина в молекулах белков-субстратов. Онкобелки семейства ras также являются ферментами, но совершенно другими. Они способны связывать нуклеотиды (особенно хорошо гуанозинтрифосфат — ГТФ) и обладают ГТФ-азной активностью. Ферментативной активности у ряда других онкобелков (продуктов генов sis, erbA и др.) пока достоверно не обнаружено. Ядерные онкобелки (продукты онкогенов туе, myb и др.) способны прочно связываться с ядерным матриксом, РНК и ДНК.

Ряд онкобелков, несомненно, имеет прямое отношение к системам лиганд — рецептор, к-рые локализованы на внешней плазматической мембране клетки и регулируют важнейшие клеточные функции, такие, напр., как вступление клеток в деление. Структура онкобелка sis очень близка к структуре белка — ростового фактора из тромбоцитов (PDGF), структура онкобелка егЬВ очень напоминает «обезглавленный» рецептор эпидермального фактора роста (EGF). Не исключено, что другие мембранные онкобелки находятся в таких же отношениях с клеточными рецепторами, структура к-рых еще не установлена.

Можно ли, исходя из этих, пока достаточно фрагментарных и неполных сведений, пытаться строить общую теорию онкогенеза на молекулярном уровне? Следует, вероятно, обратить внимание на то, что онкобелки, встречаясь в клетке почти повсеместно (мембрана, цитоплазма, ядро), лежат, по-видимому, на пути передачи сигналов извне к ядру клетки и обратно — к мембране. Можно думать, что искаженное функционирование системы передачи сигналов о необходимости для данной клетки вступить в деление, идущее из ядра или от мембраны, побуждает клетку к делению при отсутствии или нехватке обычных сигналов, воспринимаемых клетками в норме. Иными словами, клетка начинает делиться под действием собственной команды, а не команды, пришедшей извне, что и делает ее неуправляемой и не зависящей от организма в целом.

Согласно этим взглядам (разделяемым, правда, не всеми) протоонкогены кодируют в норме синтез белков, участвующих в регуляции не только деления клеток, но и их специализации и дифференцировки. При экспрессии (проявлении действия) протоонкогенов либо в неурочное время, либо в чрезмерных количествах, либо в неподготовленных к этому клетках, либо при изменении протоонкогенов возникает ситуация, когда клетка начинает делиться автономно, вне регуляторного влияния со стороны соседних клеток. При этом разные онкобелки могут включаться на разных этапах этого процесса, хотя конечный итог оказывается одинаковым, и онкобелки реализуют свой онкогенный потенциал через одну и ту же систему регуляции.

Действие онкобелков проявляется очень наглядно: если путем микроинъекций ввести в нормальные клетки онкобелок, то клетка на нек-рое время становится морфологически (фенотипически) трансформированной; наоборот, если в клетку, трансформированную онкогеном (напр., онкогеном г as), ввести антитела к онкобелку г as, то клетка на нек-рое время становится фенотипически нормальной, т. к. онкобелок г as оказывается блокированным антителом к нему. Из этих опытов следует очень важный вывод, что трансформированное состояние поддерживается активностью определенных генов через синтез их продуктов, и, если можно было бы эти гены или их продукты убрать или блокировать, то трансформированное состояние стало бы обратимым, т. е. появилась бы возможность «вылечивать» клетки. Это обстоятельство открывает совершенно новые перспективы для разработки основ рациональной терапии опухолей.

Поскольку онкобелки ответственны за поддержание трансформированного состояния, то необходимо конструировать лекарственные средства, ингибирующие их биологическую активность, напр, по типу конструирования ингибиторов ферментов на основе знания свойств последних. В связи с тем, что ряд онкобелков представляет собой ферменты, путь через избирательное ингибирование ферментативной активности по аналогии с разработанным в энзимологии для множества других ферментов может оказаться весьма плодотворным.

Другой аспект проблемы состоит в том, что появилась возможность молекулярной классификации опухолей по спектру онкобелков, обнаруживаемых в них. Это весьма существенно, т. к. группировка опухолей не по их гистологическому строению, а по молекулярному механизму возникновения, отраженному в спектре синтезируемых в них онкобелков, дает возможность бороться с ними однотипными приемами. Молекулярная классификация опухолей необходима также и для того, чтобы понять, чем определяется огромное разнообразие гистологических типов, локализаций и степени злокачественности опухолевых клеток. Мы пока практически ничего не знаем, как связан спектр экспрессируемых онкогенов с морфологическими и другими свойствами опухолей; это является предметом будущих исследований.

* *

Молекулярная биология в результате таких основополагающих достижений последних лет, как раскрытие структуры генов, молекулярных механизмов их регуляции, получение продуктов генов в чужеродных клетках, развитие методов конструирования рекомбинантных молекул ДНК, развитие «новой» биотехнологии, вплотную сблизилась с медициной и оказалась в состоянии внести существенный и все возрастающий вклад в раскрытие молекулярной природы многих болезней, в создание совершенных диагностикумов и вакцин, в получение лекарственных средств нового поколения. Сближение молекулярной биологии и медицины привело к созданию пограничной области, к-рую сейчас называют молекулярной медициной, молекулярной биомедициной или биомедициной.

Хотя вклад молекулярной биологии в современную медицину неоспорим, достаточно очевидно, что это только самое начало проникновения в нее идей и методов молекулярной биологии. В будущем этот процесс будет, бесспорно, идти и вглубь, и вширь и постепенно захватит все области теоретической и клинической медицины. Конечно, не следует думать, что только молекулярная биология обогащает медицину; не менее значительная роль принадлежит молекулярной и клеточной иммунологии, биохимии, вирусологии, генетике, но они сами столь тесно смыкаются с молекулярной биологией, что разделение на отдельные направления носит в определенной степени условный характер.

Молекулярная биология не только обогащает медицину, но и заимствует у нее нерешенные проблемы и объекты исследования. Медицина является мощным катализатором развития ряда областей молекулярной биологии, она стимулирует формирование молекулярной биологии человека, тогда как раньше основными объектами исследования молекулярной биологии были одноклеточные организмы.

Особенно велико влияние молекулярной биологии в изучении таких нерешенных или частично решенных особо сложных проблем медицины, как сердечно-сосудистые, онкологические, вирусные и наследственные болезни, т. к. по самому своему существу эти болезни теснейшим образом связаны с интимными молекулярными механизмами, регулирующими жизнедеятельность клеток. Эти проблемы долгое время не поддавались изучению именно в силу недостаточного развития молекулярной биологии и биологии клеток. Сейчас ситуация коренным образом меняется, поэтому в ближайшие годы можно ожидать крупных успехов в решении указанных проблем.

Молекулярная биология — это не только теоретическая ветвь науки о жизни, но и плодотворный, эффективный и реальный путь решения многих трудных вопросов как теоретической, так и клинической медицины, биологический фундамент рациональной, теоретически обоснованной профилактики, диагностики и терапии.

Библиогр.: Ашмарин И. П. Молекулярная биология, Л., 1977, библиогр.; Биотехнология, под ред. А. А. Баева, М., 1984; Журнал Всесоюзного химического общества им. Д. И. Менделеева, т. 29, № 2, 1984, т. 31, № 3, 1986; Забаровский Б. Р. Онкогены ретровирусов и их клеточные протоонкогены, Молек. биол., т. 19, в. 1, с. 9, 1985; Зенгбуш П. Молекулярная pi клеточная биология, пер. с нем., т. 1—3, М., 1982; Маниатис Т., Фрич Э. и Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование, пер. с англ., М., 1984; Молекулы жизни, В мире науки, № 12, 1985; Овчинников Ю. А. Биотехнология и ее место в научно-техническом прогрессе, Вестн. АН СССР, № 4, с. 4, 1982; Парнес В. А. Онковирусы, М., 1986; Рекомбинантные молекулы: значение для науки и практики, под ред. Р. Бирса и Э. Бэсита, пер. с англ., М., 1980; Уотсон Дж. Молекулярная биология гена, пер. с англ., М., 1978; Хесин Р. Б. Непостоянство генома, М., 1984; Энгельгардт В. А. Познание явлений жизни, М., 1984; Alberts В. а. о. Molecular biology of the cell, N. Y.—L., 1983; Anderson W. F. Prospects for human gene therapy, Science, v. 226, p. 401, 1984; A n t о n a-r a k i s S. E., K a z a z i a n H. H. a. O r k i n S. H. DNA polymorphism and molecular pathology of the human globin gene clusters, Hum. Genet., v. 69, p. 1, 1985; Cline M. J. Gene therapy, Molec. cell. Biochem., v. 59, p. 3, 1984; E 1 1 i s K. P. a. D a v i-e s К. E. An appraisal of the application of recombinant DNA techniques to chromosome defects, Biochem. J., v. 226, p. 1, 1985; G г a у P. W a. o. Cloning and expression of cDNA for human lympho-toxins, a lymphokinin with tumor necrosis activity, Nature (Lond.), v. 312, p. 721, 1985; К о 1 a t a G. Scrutinizing sleeping sickness, Science, v. 226, p. 956, 1984; W o n g-S t a a 1 F. a. G a 1 1 o R. C. Human T-lympho’.ropic retroviruses, Nature (Lond)., v. 317, p. 395 1 985.

Проф. Л.Л Киселев