РОЛЬ БИОХИМИИ В РАЗВИТИИ МЕДИЦИНЫ

РОЛЬ БИОХИМИИ В РАЗВИТИИ МЕДИЦИНЫ

Акад. АМН СССР В. Н. Орехович, к. б. н. JI. П. Алексеенко, к. б. н. А. Е. Б е р м а н, д. б. н. Г. Я. Видершайн, проф. В. 3. Г о р к и и, к. б. н. В. К. Городецкий, д. б. и. JI. A. JI окшина, д. б. н. И. В. Ц в е т к о в а

По вопросам, близким к освещаемой теме, в БМЭ опубликованы статьи Белки, Биохимия, Водно-солевой обмен, Гликозидозы (т. 10, доп. материалы), Гормоны, Катехоламины, Межклеточное вещество, Молекулярная биология, Молекулярная генетика, Моноа-миноксидаза, Наследственные болезни, Нуклеиновые кислоты, Онкогенез, Пептид-гидролазы, Углеводный обмен, Углеводы и др.

Стремительное развитие медико-биологических исследований в последние десятилетия 20 в. поставило биохимию в ряды наиболее бурно и успешно развивающихся наук. Благодаря ее достижениям стало возможным выяснение химических основ ключевых функций живой системы, расшифровка механизмов множества сложных процессов жизнедеятельности организма, создание средств управления этими процессами. На основе фундаментальных достижений биохимии уже в наши дни успешно решаются многие проблемы теоретической и практической медицины. Особенно важны эти достижения для медицины ближайшего будущего — медицины профилактической, т. к. они позволят распознавать самые грозные болезни человека задолго до их клинического проявления. Профилактическая медицина и охрана здоровья народа неразрывно связаны с успешным развитием биохимии на всех уровнях.

В третьем издании Большой медицинской энциклопедии было опубликовано ок. 1000 статей по биохимии, в к-рых приводится огромное количество фактических данных, имеющих существенное значение для решения проблем профилактики, диагностики и борьбы с различными заболеваниями человека. В последнее десятилетие была усовершенствована организация и научно-техническая база самого процесса биохимических исследований. Широкое использование новейших достижений физики, химии, математики и техники в биологии и медицине способствовало открытию перед биохимией принципиально новых возможностей. Биохимики могут теперь полностью расшифровать почти любую сопряженную цепь реакций, протекающих не только в клетке, но и в субклеточных структурах. В настоящее время активно изучаются связи между множеством химических реакций, составляющих материальную основу физиологических функций организма. Эта задача огромной сложности, поскольку речь идет о расшифровке бесчисленных взаимодействий между всеми системами организма, однако решению именно этой задачи биохимики уделяют сейчас особое внимание. За последние несколько лет накопился огромный фактический материал, научное осмысление к-рого в ряде случаев коренным образом меняет представления, существовавшие буквально до вчерашнего дня. Расшифровка молекулярных основ патогенеза нек-рых наследственных заболеваний, в частности так называемых болезней накопления, явилась существенным вкладом не только в теоретическую биохимию, но и в практическую медицину.

О всех достижениях биохимии за последние годы невозможно рассказать в небольшой статье, поэтому мы вынуждены ограничиться лишь кругом тех вопросов, к-рые касаются самых последних достижений в области биохимии ряда биологически активных соединений и их роли в развитии теоретической и клинической медицины.

РОЛЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В РЕГУЛЯЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

И ИХ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ МЕДИЦИНЫ

К числу фундаментальных открытий, сделанных в течение 1970—1985 гг. в различных областях биохимии и существенным образом изменивших наши представления о процессах жизнедеятельности организма в норме и при различных патологических состояниях, относится понимание протеолиза как особой формы биологического контроля. Ограниченный протеолиз служит пусковым механизмом многих биологических процессов и обеспечивает быстрый физиологический ответ организма на поступающий извне сигнал или на меняющиеся условия. Понимание регуляторной функции протеолитических ферментов имеет принципиальное значение. Это существенно как для расшифровки молекулярных механизмов сложнейших биологических процессов (напр., деления клеток, оплодотворения, морфогенеза, адаптационной перестройки, обмена веществ и др.), так и для выяснения молекулярных основ патологии. Уже сейчас ясно, что нарушение функций протеолитических ферментов и их регуляции лежит в основе многих патологических состояний. К их числу относятся нарушения сердечно-сосудистой деятельности, острые и хронические воспалительные процессы, онкологические и эндокринные заболевания, нервные и мышечные дистрофии, аутоиммунные заболевания и др. Очевидно, что точное знание конкретных функций отдельных протеиназ (пептид-гидролаз) является необходимым условием для понимания патогенеза этих заболеваний, их диагностики и рациональной терапии.

Особенностью реакций гидролиза пептидных связей является их практическая необратимость в физиологических условиях. Это определяет специфику регуляторной функции протеиназ и отличает ее от других форм биологического контроля. Под действием протеиназ осуществляется реализация и регуляция однонаправленных биологических процессов: их начало, а во многих случаях и прекращение.

Характерными чертами регулирующего эффекта протеиназ являются быстрота их действия и высокая «экономичность». Это достигается тем, что в организме с помощью одной реакции гидролиза пептидной связи, не

требующей энергетических затрат, из вещества-предшественника может легко образоваться физиологически активный белок или пептид, необходимый для начала (или прекращения) определенного биологического процесса. Протеиназы участвуют в «судьбе» белка и его превращениях начиная с самых ранних этапов биосинтеза. Они сопровождают белок, по образному выражению Нейрата (H. Neurath), «от колыбели до гроба».

Участие протеолитических ферментов в регуляции физиологических процессов связано с протеолизом двух типов: полным расщеплением белковых молекул и реакциями так называемого ограниченного протеолиза, т. е. специфического гидролиза определенных пептидных связей. Полностью расщепляя белковые молекулы, протеиназы определяют скорость распада белков в организме и участвуют в регуляции их кругооборота. Удаление из организма аномальных белков, образующихся в результате мутаций и ошибок в процессе биосинтеза, также происходит в результате их полного расщепления. Распад белковых молекул, осуществляемый путем согласованного действия различных протеолитических ферментов, происходит и при адаптационных перестройках обмена, и при различных морфогенетических превращениях.

Реакции ограниченного протеолиза, катализируемые протеиназами, имеют универсальное распространение и включены в биогенез практически всех ферментов, гормонов и других биологически активных белков и пептидов. Участвуя в их образовании, инактивации и модификации, протеиназы контролируют концентрацию основных биорегуляторов, от функционирования к-рых по существу зависит характер обмена веществ.

Сейчас не вызывает сомнений тот факт, что образующиеся в процессе трансляции (синтеза полипептидной цепи по матричной РНК в рибосомах) полипептидные цепи белков не способны сразу выполнять специфические биологические функции; для того, чтобы приобрести свою «индивидуальность», или «форму», необходимую для проявления их биологических свойств, белки должны подвергнуться посттрансляционным изменениям (модификациям), т. е. так называемому процессингу. Одним из основных механизмов процессинга является ограниченный протеолиз.

На этапе посттрансляционной модификации белка протеиназы катализируют отщепление от синтезируемой полипептидной цепи инициаторной аминокислоты (аминокислоты, с к-рой начинается рост полипептидной цепи) или так называемого сигнального пептида. Часто это происходит еще в процессе биосинтеза полипептидной цепи или сразу же после его завершения. Таким образом, протеиназы участвуют в превращении неактивных предшественников в физиологически активные белки и пептиды, что во многих случаях является пусковым механизмом соответствующих физиологических процессов. Протеиназы могут также модифицировать и инактивировать биологически активные белки. Это может приводить к перестройкам метаболизма (особенно в тех случаях, когда речь идет о ключевых ферментах обмена веществ), а также к выключению или переключению физиологических процессов.

Примером участия протеиназ в биогенезе и биотрансформации белков и пептидов может служить образование ряда гормонов и нейропептидов из полифункционального предшественника проопиомеланокортина. Этот белок синтезируется в разных отделах мозга, а также в нек-рых других органах и тканях и содержит в своей полипептидной цепи последовательности аминокислотных остатков, соответствующие структуре АКТГ, липотропина (липо-тропного гормона, ЛПГ), меланоцитостимулирующего гормона (МСГ), опиоидных пептидов (эндогенных опиатов). В результате протеолитического процессинга из проопиомеланокортина в разных отделах мозга образуются различные биологически активные продукты. Так, в передней доле гипофиза образуются АКТГ, р-ли-потропин и p-эндорфин, а в промежуточной доле — гл. обр. меланоцитостимулирующий гормон и разные формы опиоидных пептидов. Таким образом, специфический набор протеолитических ферментов в той или иной ткани может определять появление продуктов с различными биологическими свойствами из одного и того же белка-предшественника.

Протеиназы часто выполняют индукторную функцию, начиная цепь физиологических процессов; во многих случаях это связано с образованием активного фермента из его неактивного предшественника. Примерами могут служить такие защитные реакции организма, как свертывание крови, фибринолиз, активация системы комплемента и др. В основе этих процессов лежит многостадийный каскад реакций, на каждой стадии к-рого в результате ограниченного протеолиза из соответствующего профермента (зимогена) образуется протеолитический фермент, катализирующий следующую реакцию. Таким образом, ограниченный протеолиз может служить не только пусковым, но и медиаторным механизмом всего физиологического процесса.

Каскадные процессы с участием протеиназ могут протекать как вне, так и внутри клетки. Последовательность реакций в таких процессах в большинстве случаев еще не расшифрована, но уже сейчас ясно, что этим процессам принадлежит важная роль в трансформации и дифферен-цировке клетки, адаптационных перестройках обмена веществ, морфогенетических превращениях. Внутриклеточные каскадные процессы в подавляющем большинстве случаев не только включают в себя реакции, катализируемые протеолитическими ферментами, но именно эти реакции определяют однонаправленность и необратимость всего процесса в целом.

Физиологический ответ клетки на поступающий извне сигнал (воздействие гормона, антигена, ростового фактора и т. п.) связан с запуском внутриклеточных каскадов реакций. В последние годы получены данные, что в эти процессы, сопряженные с вводом в действие специализированных рецепторов, включены протеологические механизмы. Установлено, что при связывании ряда гормонов и биологически активных пептидов со специфическими рецепторами на поверхности клетки активируется находящаяся в плазматической мембране соответствующая протеиназа. Предполагают, что такая протеина-за активирует аденилатциклазу (КФ 4.6.1.1) строго определенных систем и включает тем самым всю последующую цепь реакций; в других случаях протеиназа активирует определенные протеинкиназы, запуская каскады независимых от циклических нуклеотидов реакций фосфо-рилирования. Важную роль в этих процессах играют Са2+-зависимые нейтральные протеиназы, к-рые имеют универсальное распространение и активируются при повышении концентрации ионов Са2+ в среде. Воздействуя на определенные ферментные системы клетки, рецепторные белки и белки цитоскелета, эти протеиназы участвуют в реализации многих однонаправленных процессов.

Роль протеолитических ферментов в жизнедеятельности клетки подтверждается их локализацией практически во всех субклеточных структурах: они находятся в ядре, комплексе Гольджи, секреторных гранулах, лизосомах, цитозоле, плазматических и микросомных мембранах. Локализацией в клетке обусловлены и нек-рые специфические функции протеолитических ферментов. Так, протеиназы, находящиеся в ядре, могут участвовать в катаболизме ядерных белков и регуляции транскрипции, в комплексе Гольджи — в процессинге белков, в плазматической мембране — в регуляции числа рецепторов и эффективности их функционирования.

Важным аспектом регуляторной функции протеиназ является их участие в координации взаимодействия между различными клеточными системами организма. В качестве медиаторов в таких случаях могут выступать как сами протеиназы, так и продукты протеолиза. Это особенно существенно в связи с установлением роли пептидов в межклеточных взаимодействиях, в частности роли нейропептидов в сложных нейробиологических реакциях. Сейчас ясно, что расшифровка молекулярных механизмов таких явлений, как память, эмоции, поведенческие реакции и др., невозможна без выяснения роли иротеи-наз — ферментов, участвующих в образовании и инактивации регуляторных пептидов. Нарушение нормального функционирования протеиназ может вести к изменению образования и соотношения нейропептидов в мозге, что, как предполагают, может быть причиной различных психических расстройств.

Роль протеиназы в качестве посредника в межклеточных взаимодействиях может быть показана на примере активатора плазминогена и его функции в процессе овуляции. Гонадотропный гормон вызывает секрецию активатора плазминогена гранулезными клетками фолликула, находящегося в предовуляционном состоянии. Этот активатор, поступая в фолликулярную жидкость, превращает находящийся в ней плазминоген в плазмин, к-рый инициирует ряд деструктивных процессов, приводящих к разрыву фолликула и освобождению яйцеклетки.

Важно отметить, что активатор плазминогена или другая протеиназа-индуктор, образовавшись в ничтожных количествах, могут запускать целый ряд разнообразных реакций, осуществляемых в дальнейшем плазмином или другими ферментами. В этих случаях запущенный протеи-назой каскад реакций охватывает не только компоненты плазмы крови или одной клетки, но и разные типы клеток. Таким путем обеспечивается их координированное взаимодействие и достигается резкое усиление и генерализация процесса.

Процессы локальной деструкции ткани, обусловленные кооперированным взаимодействием разных типов клеток, происходят при ряде физиологических состояшш, напр, при имплантации эмбриона в стенку матки, инволюции матки после родов и молочной железы после окончания лактации, а также при таких патологических процессах, как инвазия и метастазирование опухолей, деструкция хряща и синовиальной оболочки при ревматоидном артрите, разрушение базальной мембраны при гломеруло-нефрите и др. В этих случаях наряду с активатором плазминогена из клеток выходят другие протеолитические ферменты: коллагеназы, эластазы, кислые лизосомные протеиназы, к-рые вызывают распад близлежащих тканей.

Для понимания роли протеолитических ферментов в биоконтроле физиологических процессов необходимо знать механизмы регуляции их активности. Регуляция активности протеиназ обеспечивается гл. обр. активацией неактивных предшественников, т. к. многие протеолитические ферменты синтезируются в виде неактивных проферментов; инактивацией или удалением соответствующего ингибитора, т. к. в плазме крови, клетках и тканях присутствует мощная система ингибиторов протеиназ, специфически блокирующих активность отдельных ферментов или групп ферментов (нарушение баланса в системе протеиназа — ингибитор часто является причиной патологии); совмещением протеиназ и их субстратов, т. к. во многих случаях протеиназы и их субстраты пространственно разобщены и могут быть локализованы как в разных субклеточных органеллах или цитозоле одной и той же клетки, так и в разных типах клеток и тканей; в нек-рых случаях фермент и его субстрат находятся даже в разных органах.

Координированное взаимодействие всех трех механизмов регуляции активности протеиназ может быть продемонстрировано на примере процесса оплодотворения. В мембране акросомы сперматозоида находится протео-литический фермент акрозин, к-рый образуется из своего предшественника проакрозина в результате ограниченного протеолиза. В семенной жидкости значительная часть акрозина находится в комплексе с ингибитором. В процессе оплодотворения под влиянием протеиназ женских половых путей происходит удаление ингибитора и появляется свободный акрозин. Он расщепляет блестящую оболочку (zona pellucida) и фолликулярные клетки, окружающие яйцеклетку, и способствует тем самым проникновению сперматозоида в яйцеклетку.

Согласованное функционирование всех трех механизмов регуляции активности протеиназ (образование фермента из неактивного предшественника, удаление ингибитора и пространственное объединение фермента и субстрата за счет перемещения одного из них) обнаружено и в других системах. Таким путем достигается строгий временной и пространственный контроль многих физиологических процессов.

За последние годы значительно возрос интерес к про-теолитическим ферментам в связи с их участием в патогенезе многих заболеваний различной этиологии. К патологии приводят следующие нарушения функционирования протеиназ:

— нарушение процесса биосинтеза протеиназы или появление дефектного фермента, что происходит, напр., при нек-рых наследственных заболеваниях, р частности при гемофилии;

— появление чужеродной протеиназы, характерное, напр., для вирусных и нек-рых бактериальных инфекций;

— нарушение регуляции протеолитической активности, в частности нарушение баланса системы протеиназа — ингибитор, что может быть результатом наследственного дефекта ингибитора, напр, при эмфиземе легких, нек-рых формах мышечной дистрофии;

— выход в межклеточное пространство внутриклеточных ферментов, напр, при острых и хронических воспалениях различного генеза.

С высвобождением протеиназ связаны процессы инвазии и метастазирования опухолей. Есть данные о корреляции между метастатическим потенциалом нек-рых опухолей и величиной активности определенных протеиназ.

Во многих случаях функции отдельных протеиназ еще не установлены, и выяснение их конкретной роли в развитии той или иной патологии должно способствовать не только пониманию молекулярных основ патогенеза различных заболеваний, но и наметить пути их научно обоснованной диагностики и рациональной терапии.

НОВОЕ В ПРОБЛЕМЕ РЕГУЛЯЦИИ: РЕГУЛЯТОРНАЯ ФУНКЦИЯ СЕРДЦА

В последние годы значительно расширились наши представления о регуляторных пептидах, «запускающих», контролирующих и «выключающих» по мере необходимости сложные, подчас многоступенчатые (каскадные) процессы в организме человека и животных. Огромный фактический материал ставит исследователей перед необходимостью пересмотра классических концепций о функциях нервных и соматических клеток, о способах регуляции работы таких органов, как головной и спинной мозг, почки, сердце. В связи с этим возникают предпосылки для более углубленного понимания взаимоотношений между различными органами, что важно с точки зрения системного подхода к лечению различных заболеваний.

В биологической и физиологической химии регуляторных пептидов в последнее десятилетие сделаны чрезвычайно важные открытия, заставившие пересмотреть традиционные представления о механизмах становления сердечно-сосудистого гомеостаза, системах опиоидных пептидов, к-рые регулируют процессы, протекающие в мозге, сни

мают болевую реакцию и защищают организм от патологического воздействия стрессовых перегрузок. Появились многочисленные данные о механизме взаимодействия регуляторных пептидов с клетками-мишенями, о секреции нейронами мозга сугубо «соматических» пептидов, таких как кишечные регуляторные пептиды, кальцито-нин, ангиотензин II, кинины и др.

В последнее время появились данные о регуляторных пептидах сердца. Эти регуляторные пептиды помогают сердцу избавляться от избытка циркулирующей жидкости и электролитов, поддерживая тем самым сердечнососудистый гомеостаз.

Центральный орган системы кровообращения — сердце — известен и изучается с глубокой древности, и, казалось бы, какие-либо фундаментальные открытия в области его строения и физиологии невозможны. Тем не менее одна из важных функций сердца до последнего времени оставалась неизвестной. В 1983—1985 гг. появились работы, показавшие, что сердце человека и других млекопитающих является эндокринным органом; выяснилось, что предсердия синтезируют и секретируют в кровь полипеп-тидные гормоны, регулирующие объем циркулирующей крови и концентрацию электролитов в организме. Было установлено, что атриопептидная (предсердно-пептидная) регуляторная система сердца представляет собой сосудорасширяющую (релаксантную ) систему. Прежде в механизме поддержания сердечно-сосудистого гомеостаза были известны только сосудосуживающие (прессорные) системы: система ренин — ангиотензин — альдостерон, контролирующая синтез вазоконстрикторного пептида ангиотензина II, и система нейронов, секретирующая норадреналин. Атриопептидная регуляторная система сердца как бы противопоставлена этим прессорным системам: секретируемые предсердиями пептиды (атриопептиды) расслабляют гладкую мускулатуру в присутствии норад-реналина и ангиотензина II даже в тех случаях, когда концентрация этих прессорных веществ на порядок выше концентрации атриопептидов. Таким образом, сердце обладает возможностью «отменять» химические сигналы, посылаемые прессорными регуляторными системами.

Действие секретируемых предсердиями пептидов направлено гл. обр. на почки. Атриопептиды обладают мощным диуретическим и натрийуретическим действием. Они снижают тонус сосудов почек и усиливают клубочковую фильтрацию, стимулируют выведение ионов натрия и хлоридов, угнетая их реабсорбцию в дистальных отделах нефронов. Непосредственное действие атриопептидов на почки усиливается путем подавления прессорного действия ангиотензина II на сосуды почек и их мезангиальные клетки (мезангиоциты ), а также путем угнетения возбуждаемой ангиотензином II секреции альдостерона, задерживающего ионы натрия в организме.

Атриопептиды синтезируются и секретируются клетками миокарда (кардиомиоцитами) предсердий. Кардио-миоциты миокарда предсердий существенным образом отличаются от кардиомиоцитов миокарда желудочков. В их саркоплазме содержатся специфические гранулы, происходящие из комплекса Гольджи. По морфологическим и секреторным свойствам они ничем не отличаются от характерных гранул клеток, синтезирующих и накапливающих полипептидные гормоны, напр., таких, как клетки эндокринной ткани поджелудочной железы или клетки гипофиза. Кардиомиоциты желудочков таких гранул не содержат. Экстракты из миокарда желудочков fie обладают свойством усиливать диурез и выведение электролитов с мочой.

Сапером (С. В. Saper) и соавт. с помощью флюоресцирующих антител получены доказательства того, что гранулы кардиомиоцитов предсердий содержат атриопептиды, обладающие специфическим диуретическим и натрийуретическим действием (1985). Они являются гомологичными пептидами и получили общее название «атрио-натрийуретический фактор» (англ. ANF; син.: атриопептиды, атриопептины, аурикулин, кардионатрин, пептиды предсердий).

Пептиды, входящие в состав атрионатрийуретического фактора, были выделены, в их молекулах определена последовательность аминокислотных остатков. Выяснилось, что для проявления биологической активности атриопептидов обязательно наличие в их молекуле 17-членной кольцевой структуры, к-рая формируется дисульфидной связью между двумя остатками цистеина. В 1984 г. структуру выделенных пептидов подтвердили химическим синтезом. Дальнейшее изучение атриопептидов показало, что видовые различия в их строении незначительны: при сравнении атриопептидов человека с атриопептидами крысы выяснилось, что они отличаются лишь замещением остатка метионина на остаток изо лейцина в кольцевой структуре молекул. Пептиды, извлекаемые из экстракта предсердий, построены из различного числа аминокислотных остатков — от 23 до 106. Биологическая активность больших пептидов ниже; под действием протеолитических ферментов они превращаются в низкомолекулярные формы, а их биологическая активность при этом значительна повышается. В эксперименте на перфузируемом переживающем сердце кролика было показано, что высокомолекулярные атриопептиды в кровь не секретируются. Они являются предшественниками низкомолекулярных атриопептидов и подвергаются в кардиомиоцитах обычному для предшественников процессингу. В кровь секретируется, по всей видимости, один пептид, имеющий структуру типа ]ЧН2-сер-лей-арг-арг-сер-сер-цис-фен-гли-гли-арг* иле-асп-арг-иле-гли-ала-глн-сер-гли-лей-гли-цис -асн-сер-фен-арг-тир-СООН, остатки цистеина в к-ром связаны дисульфидной связью. В 1984 г. было установлено, что молекулы всех атриопептидов происходят от общего предшественника. Они отличаются друг от друга количеством аминокислотных остатков на N- и С-концевых участках полипептидной цепи, т. к. при выделении их и& молекулы предшественника в результате ограниченного протеолиза пептидная связь гидролизовалась на разном удалении от кольцевой 17-членной структуры. Показано, что пептиды, входящие в состав атрионатрийуретического фактора, занимают С-концевое положение в молекуле предшественника.

Из молекулы этого предшественника образуется еще один вазоактивный пептид, получивший название кардио-дилатина. Он состоит из 30 аминокислотных остатков и в молекуле предшественника занимает N-концевое положение, следуя непосредственно за так называемым сигнальным пептидом. По своей структуре кардиодилатин полностью отличается от атриопептидов: он не имеет кольцевых структур и содержит остатки пролина, к-рых нет в атриопептидах. Отличается кардиодилатин и по биологическому действию: он обладает мощным спазмолитическим действием на гладкую мускулатуру аорты и почечной артерии, но не способен усиливать мочеотделение и выведение электролитов.

Активность и содержание атриопептидов в препаратах определяют различными способами: в опытах in vivo — по усилению диуреза и экскреции ионов натрия после введения экспериментальным животным (крысам) препарата пептида; в опытах in vitro — по уменьшению спазма стенки аорты (кольца или полоски, вырезанных из нее), вызванного норадреналином или ангиотензином И, или по уменьшению спазма прямой кишки цыпленка, вызванного карбоколом, а также радиоиммунологическим и иммуногистохимическими методами с использованием флюоресцирующих антител. Каждый из методов определения активности и концентрации атриопептидов имеет свои преимущества; биологические методы определения активности атриопептидов in vivo и in vitro позволили определить зависимость физиологической активности каждого из этих пептидов от их структуры.

Радиоиммунологические и иммуногистохимические методы количественного определения атриопептидов помогли установить распространение атриопептидов в организме, концентрацию иммунореактивных атриопептидов в плазме крови человека в норме и при патологических состояниях. В 1985 г. ХарттерОхМ (E. Hartter) и соавт. были опубликованы данные о содержании иммунореактивных атриопептидов в плазме крови человека (10— 70 нг/л), полученные с помощью радиоиммунологического метода. При исследовании содержания атриопептидов в органах и тканях лабораторных животных (1985) было выявлено, что у крыс они содержатся в предсердиях, в плазме крови, почках, мозговом слое надпочечников, гипофизе, гипоталамусе (нейроны его передней области) и в головном мозге (варолиев мост).

Секрецию атриопептидов в кровь стимулирует повышение АД и увеличение объема циркулирующей жидкости, воспринимаемые механорецепторами предсердий. Системное кровяное давление атриопептиды не снижают (по крайней мере ниже нормального уровня), хотя в нек-рых экспериментах на анестезированных животных отмечали падение АД на 40 мм рт. ст. Введение экстрактов из предсердий в изолированную перфузируемую почку вызывало Са2+-зависимый мощный гемодинамический и натрий-уретический ответ. Клубочковая фильтрация при этом увеличивалась более чем в 3 раза; скорость истечения мочи повышалась в 7 раз, абсолютная экскреция ионов Na+ возрастала в 15 раз. Секретируемые предсердиями пептиды вызывают уменьшение объема циркулирующей жидкости, очевидно, не только путем массивного выведения воды и электролитов через почки, но и (в исключительных случаях) путем выхода воды в ткани в результате дилата-ции периферических кровеносных сосудов.

Механизм секреции атриопептидов кардиомиоцитами предсердий и его регуляция изучены еще недостаточно. В 1984 г. Зонненберг (H. Sonnenberg) и Фересс (A. F. Ve-ress) обнаружили, что специфическими стимуляторами секреции атриопептидов предсердиями являются аце-тилхолин, адреналин и вазопрессин. Их действие опосредуется через м-холинергические, а-адренергические рецепторы и волюморецепторы вазопрессина. Раздражение этих рецепторов не сопровождается внутриклеточным накоплением циклических нуклеотидов, а приводит к образованию инозитол-1,4,5-трифосфата, являющегося еще одним внутриклеточным веществом-посредником между полученным клеткой химическим сигналом и ферментными системами, «запускающими» ответ клетки на этот сигнал, в данном случае таким сигналом является секреция атриопептидов. Двусторонняя ваготомия приводила к потере предсердиями способности секретировать атриопептиды в ответ на увеличение объема циркулирующей жидкости.

Действие атриопептидов на почки, кровеносные сосуды и кишечник осуществляется через рецепторный механизм клеток. На плазматических мембранах клеток почек, гладких мышц и эндотелия аорты, а также коры надпочечников обнаружены рецепторы, высокоспецифические в отношении этих пептидов. Сродство атриопептидов к соответствующим рецепторам очень высоко, т. е. связываются с рецепторами они очень прочно; диссоциация пептид-рецепторного комплекса чрезвычайно мала, константа его диссоциации представляет собой величину всего лишь ок. 10-10 М. Действие атриопептидов сопровождается повышенным образованием в клетках циклического гуанозинмонофосфата, активацией мембраносвязанной гуанилатциклазы (КФ 4.6.1.2) и снижением активности фосфодиэстеразы циклического гуанозинмонофосфата (КФ 3.1.4.1). В опытах in vivo было показано, что экстракт из предсердий в 28 раз усиливает выведение с мочой циклического гуанозинмонофосфата у экспериментальных животных. Все это позволило сделать вывод, что внутриклеточным посредником действия атриопептидов является циклический гуанозинмонофосфат, синтез к-рого происходит в результате активации мембраносвязанной гуанилатциклазы. Антитела к очищенным атриопептидам тормозят накопление циклического гуанозинмонофосфата в клетках, что свидетельствует о специфических отношениях между атриопептидами и клеточной гуанилатциклазой. Аденилатциклазную систему атриопептиды угнетают.

В 1985 г. были проведены работы по изучению действия атриопептидов на человека. Исследования проводили на здоровых мужчинах-добровольцах. Введение 50 мкг атриопептидов, по данньш одних, и 125 мкг, по данным других исследователей, никакого недомогания у испытуемых не вызывало и никаких отрицательных последствий не имело. При одномоментном ввведении 50 мкг атриопептидов через 5 мин. начиналось усиление диуреза, клиренса креатинина и экскреции электролитов, оно достигало максимула через 10—20 мин., возвращаясь к исходному уровню через 45 мин. Клиренс эндогенного креатинина возрастал в 3 раза по сравнению с исходным уровнем, экскреция ионов Na+ и С1″ усиливалась в 3—4 раза, экскреция ионов К+ практически не увеличивалась. Через 1 мин. после внутривенного введения 50 мкг атриопептидов содержание их в плазме крови возрастало примерно в 30 раз по сравнению с исходным уровнем, однако через 5 мин. после введения оно превышало исходный уровень уже только в 2 раза, а через 10 мин. достигало исходного уровня, что свидетельствует об очень коротком периоде полужизни атриопептидов в кровотоке. Такую же примерно картину наблюдали и другие исследователи после введения 125 мкг атриопептидов. Таким образом, выяснено, что атриопептиды играют важную роль в регуляции функции почек и поддержании водно-солевого гомеостаза у человека, а синтетические атриопептиды рассматриваются как потенциальное лекарственное средство, к-рое может найти широкое применение при заболеваниях сердечно-сосудистой системы и почек.

Сейчас трудно представить себе, какие области и разделы медицины затронет открытие атриопептидов. Несомненно одно, что прежде всего оно будет иметь очень большое значение для изучения патогенеза сердечно-со-судистых заболеваний (включая эссенциальную артериальную гипертензию), болезней почек, эндокринных расстройств и нарушений водно-солевого обмена, а также для лечения этих форм патологии.

Изучение атриопептидов при различных патологических состояниях только начинается. На лабораторных животных (сирийских хомячках) с врожденной миокар-диопатией, сопровождающейся расширением сердца и отеками, было показано, что при такой патологии биологическая активность пептидов, синтезируемых предсердиями, ниже нормы в 3 раза, хотя содержание иммунореактивных атриопептидов у таких животных было повышено. По всей вероятности, молекулы атриопептидов при врожденной миокардиопатии у животных дефектны и не могут полноценно выполнять свою физиологическую роль.

Исследование содержания иммунореактивных атриопептидов в плазме крови больных, страдающих врожденными заболеваниями сердца, показало, что сердечно-сосудистая недостаточность, особенно тяжелые ее формы, сопровождается значительным увеличением содержания иммунореактивных атриопептидов в крови. При тяжелой сердечной недостаточности содержание атриопептидов в крови превышает норму в 10 раз. Высокая концентрация иммунореактивных атриопептидов была отмечена в венозной крови больных пароксизмальной суправентрикуляр-ной тахикардией и связанной с ней транзиторной полиу-рией.

Предпринимаются попытки изучения атриопептидов при эссенциальной артериальной гипертензии. Показано, что диуретическое и натрийуретическое действие экстрактов из предсердий крыс со спонтанной гипертензией ниже, чем аналогичное действие экстрактов из предсердий нормотензивных крыс. Введение крысам со спонтанной гипертензией экстрактов из предсердий здоровых крыс вызывает у них снижение кровяного давления, усиливает диурез и экскрецию ионов Na+. Синтетические атриопептиды у крыс со спонтанной гипертензией усиливают почечный кровоток. Атриопептиды нивелируют также гипертензию, вызываемую введением норадреналина у нормотензивных крыс, а также уменьшают тяжесть хронического метаболического алкалоза путем усиления клубочковой фильтрации.

Определение состояния секреторной функции миокарда предсердий может иметь особое значение при операциях на сердце. В опытах на крысах показано, что удаление ушка правого предсердия в 2—3 раза снижает диуретический и натрийуретический ответ на увеличение объема циркулирующей крови. В 1984—1985 гг. были опубликованы данные, свидетельствующие о возможности лечения атриопептидами геморрагического шока.

Таким образом, открытие регуляторной эндокринной системы сердца представляет собой одно из важнейших современных открытий вообще и в биохимии в частности. Оно уточняет прежние представления о механизмах становления сердечно-сосудистого гомеостаза и намечает подходы к лечению таких болезней, к-рые ранее считались неизлечимыми, открывая новые возможности для изучения их патогенеза, создает базу для получения принципиально новых лекарственных средств.

БИОСИНТЕЗ БЕЛКОВ МЕЖКЛЕТОЧНОГО ВЕЩЕСТВА И ПРОБЛЕМЫ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА

Межклеточное вещество, все чаще называемое межклеточным матриксом, представляет собой сложный структурированный комплекс макромолекул, продуцируемых различными клетками. Его основными белковыми компонентами являются коллагеновые и эластиновые белки, гликопротеиды различной природы и протеогликаны. Из гликопротеидов наибольшее внимание в последнее время привлекают так наз. адгезивные белки — фибронектины, к-рые, обладая сродством к другим структурам межклеточного вещества, а также к белкам клеточной поверхности, выполняют важные функции в структурном и функциональном объединении разнородных компонентов межклеточного матрикса и клетки.

Изучением свойств межклеточного вещества занимаются биохимики, генетики, цитологи, физиологи и исследователи многих других специальностей. Это определяется ролью, к-рую играют компоненты межклеточного матрикса как в важнейших физиологических процессах (эмбриогенезе и дифференцировке тканей, межклеточных взаимодействиях, морфогенезе органов и тканей), так и в патогенезе ряда заболеваний. Особый интерес представляет их изучение с точки зрения проблемы опухолевого роста. Эта глобальная проблема имеет много аспектов; нек-рые из них носят общебиологический характер, другие касаются вопросов, связанных с непосредственным проявлением болезни в организме. Очевидно, что важнейшее значение имеет вопрос о том, чем определяется неконтролируемое и «бесконечное» размножение опухолевой клетки, ее «бессмертие». Но также важно понимание того, какими механизмами осуществляет опухоль те свои свойства, к-рые составляют ее «злое качество», т. е. инвазию, разрушение окружающих тканей и распространение по организму в форме метастазов. К этой второй проблеме — вопросам взаимодействия опухоли и организма — биохимия межклеточного вещества имеет непосредственное отношение, потому что опухоль любого происхождения, структуры и степени злокачественности развивается и распространяется через межклеточный матрикс и во взаимодействии с ним.

Многочисленные данные указывают на то, что злокачественное перерождение клеток сопровождается существенными нарушениями образования коллагена, протео-гликанов и фибронектина. Содержание любого белка определяется балансом двух процессов — его синтеза и распада. Синтез белков осуществляется в несколько стадий, к-рые включают транскрипцию (синтез матричной РНК по ДНК), трансляцию (синтез полипептидной цепи белка по матричной РНК в рибосомах), модификацию белковых молекул после их синтеза и транспорт белка из клетки. Оказалось, что в клетках опухолей различного происхождения резко подавлен синтез коллагеновых белков и фибронектина на первой из указанных стадий — транскрипции, т. к. блокирован синтез соответствующих матричных РНК. Наиболее демонстративно это явление обнаруживается при анализе растущих в культуре клеток, зараженных опухолеродным вирусом. Такие клетки сохраняют свойства, присущие клеткам растущих в организме опухолей и при пассировании их животным могут давать начало опухолевым узлам, метастазировать и т. д. Однако, если клетки в культуре заражать штаммами онкогенного вируса с термочувствительной мутацией, то малигнизация (злокачественная трансформация) клеток происходит только при определенной температуре (так наз. пермиссивная температура). При непермиссивной («запрещающей») температуре злокачественной трансформации не происходит. Таким образом, с помощью этого легко и быстро изменяющегося параметра можно исследовать в динамике признаки, сопутствующие малигнизации клеток. Использовав этот прием, Йосимура (М. Yoshimura) и соавт. (1981) обнаружили, что фибробласты и хондроциты, инфицированные термочувствительным штаммом вируса Рауса, вызывающего саркому у птиц, теряют способность к синтезу коллагена в условиях пермиссивной температуры, однако восстанавливают синтез коллагена при температуре, неблагоприятной для злокачественной трансформации. В том же 1981 г. Собел (М. E. Sobel) и соавт. установили, что в условиях, благоприятных для малигнизации, содержание в клетках матричной РНК коллагена снижается в 10 раз по сравнению с нормой.

Важно подчеркнуть, что особенности, установленные для коллагена, оказались полностью характерными для синтеза в нормальных и опухолевых клетках другого белка межклеточного вещества — фибронектина (1983). Однако для этого белка в случае опухолевого роста было свойственно не только (и не столько) снижение интенсивности его синтеза, сколько его исчезновение с клеточной поверхности, на к-рой он, как указывалось выше, играет роль адгезивного («склеивающего») агента, обеспечивающего взаимодействие клеток с другими компонентами межклеточного вещества.

В тканях злокачественных опухолей обнаружен фибронектин, углеводная часть молекулы к-рого больше, чем в молекуле фибронектина из нормальных тканей. Другой особенностью фибронектина, продуцируемого опухолевыми клетками, является повышенное содержание в его молекуле остатков фосфорной кислоты.

Снижение интенсивности синтеза в количественном отношении или продукция атипичного (модифицированного) белка характерны и для третьего основного белкового компонента межклеточного матрикса — протеогли-канов. Обнаружено, что у «опухолевых» протеогликанов скорость включения в белковую молекулу сульфата и ацетата отличается от нормы.

Интересные закономерности обнаружены при изучении разрушения белков межклеточного вещества в нормальных и опухолевых тканях. Нужно отметить, что разрушение «старых» молекул и их замена вновь синтезированными является естественным процессом, протекающим в нормальной ткани и затрагивающим все ее

компоненты, в т. ч. межклеточное вещество. Однако в опухолевых тканях протеолитические ферменты значительно активизируются и расщепление межклеточного матрикса резко ускоряется. Было установлено, напр., что образование коллагеназы (КФ 3.4.24.3), фермента, специфически расщепляющего коллаген, является характерной особенностью метастазирующих опухолей. Более того, выяснилось, что метастазирующая активность клеток опухолей различного гистогенеза (саркомы и меланомы) находится в прямой зависимости от продукции коллагеназы, специфически расщепляющей коллаген типа IV, т. е. тот коллаген, к-рый составляет основу базальной части плазматических мембран.

Р1так, в опухолевой клетке протекают процессы, направленные на угнетение внутриклеточного синтеза белков межклеточного вещества и на ускоренный распад этих белков вне клетки. В «агрессии» опухоли эти свойства ее клеток как бы помогают расчищать им путь для инфильтрации здоровых тканей, прорастания сосудов и распространения метастазов. Исчезновение с поверхности клеток фибронектина делает их менее «привязанными» к субстрату, более подвижными, стимулирует начало митозов, т. е. способствует обособлению их от клеточного сообщества, выведению из-под контроля организма, что облегчает малигнизацию.

Таким образом, можно предположить, что вещества, стимулирующие синтез белков межклеточного вещества или препятствующие их распаду, будут обладать противоопухолевым действием. Действительно, поиск таких средств имеет определенную перспективу. Однако надо учитывать исключительную неоднородность опухолевых клеток различного происхождения, разнообразие их свойств, зависимость их качества в каждом конкретном случае от генеза, уровня дифференцировки, микроокружения и многих других условий.

Приведенные выше сведения о торможении синтеза белков межклеточного вещества в основном получены

при исследовании клеток мезенхимного ряда. В сравнении с ними и с точки зрения вышеизложенных соображений представляется парадоксальной особенность нек-рых линий опухолевых клеток эпителиального происхождения, заключающаяся в том, что в таких клетках не только не блокирован синтез коллагена, а, напротив, он протекает значительно более интенсивно, чем в исходных, нормальных, клетках. Аналогичные данные были получены Кески-Оджа (J. Keski-Oja) и соавт. (1982), изучавшими синтез фибронектина опухолевыми клетками эпителиального происхождения.

Такие, казалось бы, разнонаправленные свойства опухолевых клеток различного происхождения свидетельствуют о двойственном характере взаимодействия опухоли и межклеточного вещества. Опухолевая клетка не может полностью обособиться от окружающего ее вещества, от стромы и питающих ее сосудов. Более того, волокнистые структуры, образованные коллагеновыми и фибронекти-новыми молекулами, служат не только препятствием для распространения, но и способствуют расселению опухолевых клеток, двигающихся вдоль таких структур. И, наконец, соединительнотканные образования (напр., капсула опухоли) являются своего рода щитом, предохраняющим ее от противоопухолевого иммунного ответа организма.

Поэтому, по-видимому, в ходе эволюции опухоли на протяжении ряда клеточных генераций формируется такой клон опухолевых клеток, к-рый реализует оптимальный вариант синтеза белков межклеточного вещества, т. е. оптимально способствующий «выгодному» для опухоли взаимодействию с окружающей средой. Понимание этих и выявление новых закономерностей роли межклеточного вещества в опухолевом росте представляется важной задачей биохимии, решение к-рой откроет еще один путь для исследований в области создания комплексной патогенетической терапии опухолевых заболеваний.

ДОСТИЖЕНИЯ В ОБЛАСТИ БИОХИМИИ БИОГЕННЫХ АМИНОВ

Первая половина 80-х гг. 20 в. характеризовалась быстрым развитием комплексных исследований в области биохимии биогенных аминов. Широко проводились научные исследования, ориентированные на создание новых способов лечения и предупреждения патологических состояний, в основе к-рых лежит нарушение синтеза и катаболизма биогенных аминов, а также на детальное изучение патогенеза таких состояний, разработку новых методов их диагностики и прогнозирования.

Новые данные о биосинтезе биогенных аминов

В результате фундаментальных исследований процессов биосинтеза катехоламинов (1982) получены доказательства синтеза адреналина в тканях мозга, раскрыты его биологическая роль, патогенетическое значение при гипертонической болезни, и на этой основе созданы оригинальные гипотензивные лекарственные средства с механизмом действия, отличающимся от механизмов действия традиционных препаратов. Ранее полагали, что биосинтез адреналина и норадреналина осуществляется только в мозговом слое надпочечников, клетки к-рого считали единственным местом локализации фермента фенилэтаноламин-1Ч-метилтрансферазы (ФЭМТ), катализирующей образование адреналина из норадреналина. Теперь установлено, что ФЭМТ содержится также в тех структурах стволовой части головного мозга, к-рые участвуют в центральной регуляции кровяного давления. Доказано существование корреляции между активностью ФЭМТ в тканях головного мозга и уровнем кровяного давления. Созданы новые, избирательно действующие ингибиторы ФЭМТ, из числа к-рых в условиях це

лостного организма наиболее эффективными оказались неароматические аналоги фенилэтанол амина (напр., 2-циклооктил-2-оксиэтиламин). С помощью этих соединений удалось избирательно блокировать активность ФЭМТ в гипоталамусе крыс со спонтанной гипертензией, в результате чего концентрация адреналина (но не норадреналина) в тканях снижалась, что прямо коррелировало со степенью снижения кровяного давления. Можно ожидать, что эти исследования станут принципиальной предпосылкой для создания новых лекарственных средств, используемых для лечения гипертонической болезни человека.

Установлено, что в организме человека скорость биосинтеза нейромедиаторов-моноаминов могут лимитировать не только гидроксилазы (как было принято считать ранее), но и декарбоксилазы ароматических аминокислот (ДКАА). В связи с этим перспективным направлением представляется создание практически не проникающих сквозь гематоэнцефалический барьер специфических ферментактивируемых ингибиторов декарбоксилаз, представляющих собой фторпроизводные а-ме-тил-3,4-диоксифенилаланина. Эти ингибиторы могут быть использованы для лечения (в сочетании с ле-водопа) паркинсонизма, а также других заболеваний, напр, хромаффиномы.

Тканевые резервы биогенных аминов

иа 1ЮС Л0ДНИ£5 1 ОДЫ UblJI ВЫЯСпсп ОНО-*

химический механизм освобождения биогенных моноаминов из тканевых резервов под воздействием ионофоров — веществ, избирательно связывающих определенные ионы. Установлено,

в частности, что моненсин (природное макроциклическое соединение, предпочтительно связывающее ионы натрия) вызывает выход серотонина, дофамина или норадрена-лина из синаптосом мозга или тромбоцитов крови благодаря изменению протонного градиента и мембранного потенциала биологических мембран (но не в результате нарушения образования АТФ или стимуляции экзоцитоза). Установлено, что под действием моненсина нор-адреналин выходит из хромаффинных гранул в цитоплазму клеток хромаффиномы, в результате чего происходит угнетение активности тирозингидроксилазы (КФ 1.14.16.2) и снижение скорости биосинтеза катехоламинов в целом.

Можно предполагать, что в ближайшем будущем на основе расшифровки биохимического механизма действия ионофоров на тканевые резервы биогенных аминов будут проводиться не только фундаментальные исследования природы таких резервов, но и работы, ориентированные на создание новых лекарственных средств, воздействующих на тканевые резервы биогенных аминов и предназначенных для лечения заболеваний сердечно-сосудистой и нервной систем.

Катаболизм биогенных аминов

В настоящее время в области биохимии биогенных аминов наметилась тенденция к преимущественному развитию исследований именно в направлении изучения их катаболизма, что в будущем может дать качественно новый стимул прогрессу в ряде разделов клинической медицины.

За последние годы (1982—1984) получены моноклональные антитела против очищенной моноаминоксидазы типа Б из тромбоцитов крови человека. Эти антитела использовали для приготовления иммуносорбента, избирательно связывающего моноаминоксидазу типа Б печени человека, но не связывающего моноаминоксидазу типа А. Было установлено, что препаративное разделение множественных форм моноаминоксидазы головного мозга человека может быть осуществлено как с помощью этого иммуносорбента (1985), так и обычными методами ионообменной хроматографии (1984) при условии разрушения биологических мембран поверхностно-активными веществами типа октилглюкопиранозида. Создание таких поверхностно-активных веществ было важным достижением химии вообще, в том числе в плане их использования для изучения мембраносвязанных белков, ферментов и особенно рецепторов.

Таким образом, в этих работах получены новые доказательства существования множественных форм моноаминоксидазы, различающихся не только функционально, но и структурно, что позволяет разделять их препаративно и составляет важную теоретическую предпосылку для изыскания новых избирательно действующих бло-каторов или активаторов реакций окислительного дезаминирования различных биогенных аминов. Соединения, обладающие этими свойствами, могут быть использованы в качестве лекарственных средств при нервно-психических заболеваниях, гипертонической болезни, ревматоидном артрите и, возможно, в качестве иммуномодуляторов.

В 1985 г. было обнаружено, что при шизофрении нарушается обратимость процесса качественного модифицирования каталитических свойств множественных форм моноаминоксидазы головного мозга человека (исследования проводили на очищенных препаратах изоформ фермента) . Полученные результаты согласуются с данными, свидетельствующими о важной роли нарушений гиста-минергических процессов в патогенезе шизофрении.

Открыты неизвестные ранее особенности биохимического механизма действия ряда токсических факторов окружающей среды на организм человека. На протяжении последних 40 лет токсическое действие подобных факторов обычно объясняли нарушением функций холинерги-ческих нейронов. В начале 80-х гг. 20 в. появились указания на возможное значение нарушений структуры

и функций моноаминергических нейронов в механизме токсичес’кого действия ряда производных карбаминовой к-ты, пиридина и других соединений. Так, доказано (1985), что высокая избирательная нейротоксичность

1-метил-4-фенил-1,2,5,6-тетрагидропиридина для приматов и человека обусловлена его опосредованным специфическим взаимодействием с моноаминоксидазой типа Б и избирательным разрушением дофаминергических нейронов в черной субстанции стволовой части головного мозга. Эти исследования привели к созданию новой экспериментальной модели паркинсонизма. Можно ожидать, что в будущем с учетом достижений этого быстро развивающегося направления в области биохимии аминов будут пересмотрены представления о патогенезе и путях профилактики паркинсонизма и дрожательного паралича.

Очищенные препараты моноаминоксидазы могут быть использованы для терапии нек-рых форм лучевой болезни и других заболеваний, сопровождающихся*существенны-ми нарушениями функций симпатоадреналовой системы. Препараты моноаминоксидазы из мозга животных обнаруживали гипотензивное и антиаритмическое действие. Антитела к различным изоформам моноаминоксидазы могут быть использованы при диагностике заболеваний нервной и сердечно-сосудистой систем.

За последние годы значительно возрос интерес к обратимо действующим субстратно-избирательным ингибиторам моноаминоксидазы, и в первую очередь к ингибиторам моноаминоксидазы типа Б. Установлено, что длительное введение стареющим животным ингибитора моноаминоксидазы типа Б — депренила устраняет нарушения дофаминергических процессов, сопровождающих старение организма (в частности, постепенное угасание функций эндокринных желез), в основе к-рых лежит постепенно развивающееся по мере старения организма относительное увеличение активности моноаминоксидазы типа Б в тканях мозга по сравнению с активностью моноаминоксидазы типа А. Предполагается в будущем использовать депренил (или другие избирательные ингибиторы моноаминоксидазы типа Б) как лекарственное средство, безопасное для человека при длительном применении, в геронтологии в основном с целью предупреждения и устранения старческих депрессивных состояний, старческого угасания функций половых желез.

Новые оригинальные отечественные антидепрессанты полициклического строения (напр., пиразиноиндолы), внедренные в последнее время в медицинскую практику (1982), являются весьма избирательными ингибиторами моноаминоксидазы типа А. Преимущество азотсодержащих полициклических ингибиторов этого фермента перед ацетиленовыми аминами, широко применяемыми в настоящее время в качестве субстрат-избирательных ингибиторов моноаминоксидазы, заключается, в частности, в том, что избирательность их действия проявляется не только при их использовании в низких концентрациях (или дозах), но и практически при любых концентрациях. Напр., один из наиболее эффективных новых антидепрессантов, представитель пиразиноиндо лов — пиразидол (пирлиндол) даже в высоких дозах не блокирует активность моноаминоксидазы типа Б, благодаря чему беспрепятственно осуществляется окисление тирамина. Эта особенность действия пиразиноиндо лов объясняет тот факт, что побочные эффекты при их использовании в клинике возникают относительно редко. В будущем можно ожидать быстрого развития исследований механизма ингибирования ферментативных превращений биогенных аминов полициклическими (и гетероциклическими) соединениями с целью изыскания новых эффективных субстрат- и органоизбирательных ингибиторов моноаминоксидазы обратимого действия.

Важным представляется вопрос об активаторах моноаминоксидазы, исследования к-рых осуществляются,

в частности, в связи с изучением патогенеза ряда заболеваний нервной системы и с расшифровкой биохимических механизмов токсического действия нек-рых инсектицидов. В будущем можно ожидать углубление систематических исследований зависимости активирующего эффекта этих соединений от их химического строения, например в рядах производных гидразина, карбаминовой кислоты и др., активирующие свойства отдельных представителей которых в отношении моноаминоксидазы уже описаны.

УСПЕХИ И ПЕРСПЕКТИВЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ И МЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИХ БИОПОЛИМЕРОВ

Биохимические исследования в области углеводов давно уже опровергли прежние представления о том, что основная роль этого класса соединений заключается в обеспечении клетки энергетическим и пластическим материалом. В последние два десятилетия (1965—1985) стало очевидным важнейшее значение углеводсодержащих биополимеров, или гликоконъюгатов (гликопротеидов, гликолипидов и гликозаминопротеогликанов), в реализации различных процессов жизнедеятельности. Установлено, что специфические рецепторы, связывающие нек-рые гормоны, токсины, бактерии и вирусы, являются гликоконъюгатами. Гликоконъюгаты участвуют в межклеточных взаимодействиях, транспорте ионов через биологические мембраны, определяют антигенные свойства клеточной поверхности, они рассматриваются как медиаторы иммунного ответа и специфические маркеры в процессе онкогенеза. Биологическая активность многих гликоконъюгатов определяется именно углеводным компонентом их молекулы.

Чтобы оценить важность достижений биохимии углеводсодержащих соединений в понимании нормальных процессов жизнедеятельности и их изменений при патологических состояниях, достаточно рассмотреть несколько биологических феноменов (узнавание молекул и клеток, межклеточные взаимодействия, специфическую рецепцию и направленный транспорт) и нек-рые наследственные нарушения обмена углеводсодержащих соединений, интенсивно изучавшиеся в 1975—1985 гг.

Так, при изучении обмена гликопротеида церулоплазмина при болезни Вильсона—Коновалова (гепатоцереб-ральной дистрофии) было обнаружено, что он быстро исчезает из кровотока после отщепления от его молекул остатков сиаловых кислот (так называемого десиалиро-вания). Дальнейшие исследования показали, что именно концевые остатки сиаловых кислот в составе многих гликопротеидов (фетуина, орозомукоида, интерферона, гаптоглобина, эритропоэтина, транскортина, гонадотропного и фолликулостимулирующего гормонов и др.) определяют время нахождения этих гликоконъюгатов в кровотоке. При десиалировании гликопротеидов это время сокращается с десятков часов до нескольких минут. У всех исследованных гликопротеидов после отщепления сиаловых кислот концевым углеводным остатком становится остаток галактозы, и все эти гликопротеиды, исчезая из кровотока с разной скоростью, обнаруживаются в клетках паренхимы печени. Аналогичные результаты были получены в отношении клеток крови, в частности эритроцитов, к-рые также после отщепления с их поверхности сиаловых кислот быстро исчезали из кровотока. «Старые» эритроциты содержали меньше сиаловых кислот, и не исключена возможность, что именно десиали-рование является процессом, регулирующим время жизни этих клеток крови. О значении углеводной части в молекулах биополимеров для времени нахождения этих молекул в кровотоке и их направленного транспорта свидетельствуют данные о том, что не только концевые остатки галактозы, но и остатки других моносахаридов могут «направлять» молекулы и клетки в определенные ткани. Так, L-фукоза, связанная с N-ацетилглюкозамином а-1 —> 3-связью, распознается гепатоцитами, а концевая манноза — клетками почек, а также ряда органов и тканей системы мононуклеарных фагоцитов (ретикулоэндоте-лиальной системы). Открытие роли концевых сахаров в судьбе молекул в циркуляции заставило пересмотреть представление о том, что биологическая активность ряда гормонов (в частности, фолликулостимулирующего и гонадотропного) обусловлена одним из концевых сахаров в их молекулах. Это представление было основано на том, что при отщеплении, напр., концевых остатков сиаловых кислот от молекулы гормона не удавалось определить биологическую активность этого гормона при введении его десиалированного препарата в кровоток. Действительной причиной потери активности десиали-рованных гормонов оказалась их неспособность достигать клеток-мишеней из-за того, что они быстро исчезают из кровотока и связываются гепатоцитами.

Сейчас не вызывает сомнений, что реализация сигнала об удалении биополимера из кровотока опосредуется через ряд клеточных рецепторов, к-рые также часто являются гликопротеидами. По-видимому, в организме функционируют определенные рецепторные системы, осуществляющие направленный транспорт различных молекул и клеток. Нек-рые из рецепторов таких систем были выделены, причем была изучена не только их структура, но и механизм функционирования в клетке. Это прежде всего относится к рецептору, специфичному в отношении концевой галактозы (галактозила), с помощью к-рого молекулы, содержащие такую галактозу, попадают в гепатоциты. Галактозильный рецептор, или рецептор для асиалогликопротеидов, к-рый в научной литературе называют НВР (англ. hepatic binding protein), является гликопротеидом; в составе его молекул содержатся концевые остатки сиаловых кислот, присоединенные к предшествующим галактозным остаткам в углеводных цепях рецептора. Установлено, что концевые остатки сиаловых кислот экранируют галактозные остатки в молекулах НВР, не позволяя последним занять центры связывания асиалогликопротеидов. Такая внутримолекулярная защита связывающего центра НВР обеспечивает эффективное удаление десиалированных молекул из кровотока. Имеет ли эта рецепторная система значение в регуляции содержания асиалогликопротеидов в организме человека, до конца не выяснено. Однако косвенные данные свидетельствуют в пользу ее участия в этом процессе, т. к. при нек-рых деструктивных заболеваниях печени, таких, напр., как цирроз и гепатит, содержание асиалогликопротеидов в сыворотке крови в 2—3 раза превышает норму.

Вторым рецептором, специфичным к остаткам сахаров, к-рый был выделен и очищен, является рецептор для маннозо-6-фосфатных группировок лизосомных гидролаз. Открытие этого рецептора так же, как и маркерных свойств маннозо-6-фосфата, связано с выяснением биохимических основ одной из болезней накопления, получившей название I-клеточной болезни, или I-Cell disease (муколипидоз II). Повышенное «вытекание» лизосомных ферментов из фибробластов при этом заболевании, к-рое объясняли сначала повреждением лизосомной мембраны, оказалось обусловленным дефектом в фосфорилировании маннозных остатков в молекулах этих ферментов, являющихся гликопротеидами. Дефектные молекулы фермента не способны достигать лизосом и удерживаться в них. Отсутствие маркерных маннозо-6-фосфатных группировок не позволяет специфическому рецептору

«узнать» фермент и обеспечить его попадание в соответствующие субклеточные структуры, в частности в лизосомы.

Эти данные вместе с известными в настоящее время данными о нематричном (посттрансляционном) биосинтезе углеводных цепей гликопротеидов позволили составить схему биогенеза и внутриклеточного 1:ранспорта лизосомных ферментов фибробластов человека.

Рецептор, специфически «узнающий» фосфорилированные молекулы гидролаз, связывание с к-рыми служит сигналом к окончанию посттрансляционного гликозили-рования, выделен и очищен до гомогенного состояния, к нему получены моноклональные антитела и установлено, что этот рецептор является интегральным компонентом внутриклеточных везикул и пронизывает их мембрану. Предполагают, что такое положение рецептора в мембране объясняет его способность к рециклизации, или челночному механизму, и позволяет ему не попадать в лизосомы. То же характерно и для галактозильного рецептора НВР, к-рый способен «проводить» связанные с ним сывороточные асиалогликопротеиды от плазматической мембраны через эндоплазматическую сеть и комплекс Гольджи в лизосомы, после чего, не попадая в лизосомы, он снова возвращается на плазматическую мембрану и способен связывать новые молекулы асиалогли-копротеидов.

Эти данные свидетельствуют о том, что в клетке реализуется четкая программа, обеспечивающая внутриклеточный транспорт самых различных по структуре и биологической активности соединений. Нарушение хотя бы одного звена этой программы, напр, фосфорилирования, приводит к тяжелой патологии. Это подтверждается серией экспериментальных работ, по данным к-рых блокирование различных стадий биосинтеза углеводных цепей гликоконъюгатов с помощью специфичных ингибиторов приводит к изменению в структуре углеводных цепей, искажению их внутриклеточного транспорта ж к быстрому ферментативному разрушению этих гликоконъюгатов.

Таким образом, установлено, что углеводный компонент гликоконъюгатов играет весьма существенную роль не только в определении направленного транспорта молекул и клеток в кровотоке, но и во внутриклеточном транспорте.

Основой нового и практически значимого аспекта биохимических исследований углеводсодержащих соединений стало выявление систем углеводных маркеров и «узнающих» их рецепторов. Это связано с разработкой методов направленного транспорта биологически активных веществ, в частности ферментов. Полагают, что можно будет преодолеть ряд трудностей в разработке методов заместительной энзимотерапии путем так называемого рецептор-опосредованного транспорта, вводя определенные концевые сахара в молекулы ферментов, используемых в качестве лекарственных средств и представляющих собой гликопротеиды. Эти трудности заключаются в быстром выведении или разрушении в организме введенных ферментных препаратов и их неспособности попадать в пораженный орган или ткань. В экспериментах in vitro была показана возможность использования рецептор-опосредованного транспорта для направленного введения в гепатоциты веществ, защищающих эти клетки от побочного действия нек-рых химиотерапевтических агентов, в частности метотрексата. Для этой цели антагонист метотрексата конъюгировали с асиалофетуином. Оказалось, что культивируемые in vitro клетки гепатомы, обладающие галактозильным рецептором, были защищены от токсического действия метотрексата, если в культуральную среду добавляли этот конъюгат. Клетки другого типа, не несущие на мембране подобного рецептора, при воздействии метотрексата погибали полностью даже в присутствии конъюгата антагониста метотрексата с асиалофетуином, т. к. последний не мог в них проникнуть и оказать защитного действия. Этот подход, безусловно, может быть использован в разработке принципиально новых методов органоспецифической химиотерапии.

Кроме обеспечения направленного транспорта различных соединений с помощью углеводных детерминант, в биохимической литературе последних лет обсуждается вопрос о возможности применения таких детерминант для стабилизации вводимых в организм веществ. Ферментативное или химическое гликозилирование сейчас рассматривается как один из эффективных методов стабилизации ферментов. Было показано, что после присоединения углеводного компонента к нек-рым ферментам (трипсину, лизоциму, а- и |3-амилазам, р-глюкозидазе и РНК-азе) их термостабильность и устойчивость к действию протеолитических ферментов значительно повышались.

В организме человека выявлено много рецепторных систем, где именно углеводсодержащие соединения с высокой степенью избирательности «узнают» и связывают молекулы, действующие затем на клетку. Так, связывание холерного токсина с плазматической мембраной клеток-мишеней осуществляется через GM -ганглиозид,

а токсина столбняка — с помощью GD -и GT -ганглио-

_ ib i зидов, к-рые отличаются от GM -ганглиозида наличием

дополнительных остатков нейраминовой кислоты. Установлена роль отдельных моносахаридов или определенных последовательностей их остатков в углеводной цепи гликоконъюгатов в связывании не только токсинов, но и инфицирующих организм бактерий и вирусов. Углеводсодержащие рецепторы опосредуют и взаимодействие клеток с гормонами. Так, в связывании инсулина участвуют остатки нейраминовой кислоты и галактозы, входящие в состав рецептора, специфического для этого гормона. Рецептор гликопротеидной природы, связывающий серотонин, найден в ц. н. с.

Специфические рецепторы — гликопротеиды обнаружены и в иммунной системе организма. Это, напр., рецептор макрофагов, к-рый связывает вещество-медиатор MIF, выделяющийся сенсибилизированными лимфоцитами и подавляющий миграцию макрофагов. Рецептор терял способность связывать MIF, если от него отщепляли концевой остаток фукозы.

Набор специфических рецепторов клетки, вероятно, очень велик, и выяснение их природы представляет не только теоретический интерес. Как видно из приведенных выше примеров, знание ответственных за специфичность рецептора углеводных детерминант открывает возможность направленного воздействия на самые различные процессы жизнедеятельности при их нарушении. Помимо уже указанных новых подходов к разработке методов заместительной энзимотерапии и органоспецифической химиотерапии, углеводные маркеры позволили уже сейчас вводить ферментные препараты с помощью так называемых тропных липосом, а также создавать эффективные вакцины и антибактериальные препараты.

Важным для медицины является доказательство участия г л ико конъюгатов в межклеточных взаимодействиях.

Об этом свидетельствует то, что выделенные из разных объектов факторы агрегации оказались гликопротеидами и что межклеточная адгезия в ряде случаев осуществляется в результате фермент-субстратного взаимодействия между гликозилтрансферазами поверхности одной клетки и акцепторами другой, причем эти акцепторы являются гликопротеидами или г л ико липидами. В последние годы установлено, что значительное уменьшение адгезии при опухолевой трансформации клеток сопровождается заметным изменением активности нек-рых гликозилтрансфераз и структуры гликоконъюгатов клеточной поверхности, а также изменением их качественного состава. Опухолевые клетки теряют способность к контактному торможению. Изменения в качественном составе гликопротеидов поверхности опухолевой клетки приводят иногда к полному исчезновению в нек-рых из них такого, напр., белка, как LETS (англ. Large External Transformation Sensitive Protein). Это также снижает адгезивные свойства опухолевых клеток, поскольку подобные белки играют роль межклеточного клея, «соединяющего» клетки в норме. В то же время в опухолевых клетках появляются гликоконъюгаты, отсутствующие в нормальных клетках, в частности гликолипиды, содержащие остатки фукозы, к-рые рассматриваются сейчас как специфические маркеры онкогенеза, и их обнаружение может иметь диагностическое значение.

Большой интерес для медицины представляют биохимические исследования, показавшие роль углеводсодержащих соединений в определении антигенной специфичности биополимеров. Это относится к изучению группоспецифических веществ крови, а также к антигенам тканевой совместимости, к-рые ответственны за иммунный ответ организма при пересадке органов и тканей.

Разработка методов пренатальной диагностики генетически обусловленных болезней накопления углеводсодержащих биополимеров положила начало важному направлению в профилактике многих наследственных заболеваний, к-рое позволило перейти при медико-генетическом консультировании от предсказания степени риска рождения больного ребенка к точной оценке состояния плода.

Биохимические исследования при болезнях накопления постоянно выявляют новые особенности обмена гликоконъюгатов, к-рые дают возможность понять причины чрезвычайно высокой гетерогенности этих заболеваний, совершенствовать методы их диагностики и разрабатывать подходы к их коррекции. Так, оказалось, что очень важно знать характер ферментного дефекта, к-рый может заключаться в отсутствии фермента, нарушении его каталитических свойств или регуляции активности. Важно также изучит^ влияние основного ферментного дефекта на другие обменные реакции, формально не затронутые тем или иным метаболическим блоком. Исследования подобного рода показали, что нарушение одного звена обмена часто приводит к существенным изменениям других обменных реакций, к активации тех альтернативных путей обмена, к-рые в норме имеют второстепенное значение, или к запуску новых метаболических реакций, вообще не имеющих места в здоровом организме. Выяснение отмеченных особенностей позволяет в ряде случаев не только получить новые представления о взаимосвязи обменных процессов в норме и при патологии, а также об адаптивных возможностях организма, но и выработать правильную тактику лечения. Примером эффективности именно таких биохимических исследований служит найденный в последнее время подход к лечению гликогеноза III типа, вызванного генетически обусловленной недостаточностью фермента амило-1,6-глюкозидазы. Терапевтический эффект был получен путем гормональной активации другого фермента, участвующего в обмене гликогена, — глюкозо-6-фосфатазы. Многое может дать и оценка влияния на обмен веществ тех соединений, к-рые накапливаются в организме при отсутствии того или иного фермента. Так, накопление фруктозо-6-фосфата при фруктоземии приводит к ингибированию еще четырех ферментов углеводного обмена, что необходимо учитывать, трактуя биохимический механизм нарушений при фруктоземии и выбирая методы ее коррекции.

Однако изучение углеводсодержащих соединений при болезнях накопления, наряду с решением задач практической медицины, часто приводит к обнаружению фактов, важных в теоретическом отношении. Так, в результате исследований, посвященных различным формам ряда лизосомных болезней, в частности гликолипидозов, были открыты специфические белки — активаторы соответствующих лизосомных гидролаз. Эти белки являются, по-видимому, естественными детергентами, необходимыми для ферментативного расщепления высокомолекулярных природных субстратов липидной природы. Отсутствие таких белков является основным дефектом при нек-рых формах гликолипидозов. В норме при ферментативном гидролизе нек-рых г лико липидов сначала, по-ви-димому, образуется комплекс субстрат—активатор, к-рый и соединяется с ферментом. Только после образования такого комплекса происходит каталитический акт отщепления того или иного моносахаридного остатка от гликолипида. Открытие еще одного варианта гликоли-пидоза, а именно Ом2-ганглиозидоза, при к-ром в организме имеется и фермент, и белок-активатор, а дефект касается структуры связывающего активатор центра фермента, в очередной раз продемонстрировало, насколько сложны взаимодействия лизосомных ферментов и их субстратов в клетке.

Другим примером подобного рода является исследование модели гликогеноза, вызванного дефектом киназы фосфорилазы 6, предпринятое с целью разработки метода пренатального выявления болезни. При этом гликоге-нозе нарушается переход фосфорилазы b в фосфорилазу а. Изучение катализирующей эту реакцию киназы привело к открытию в ее составе Са2+-зависимого белка кальмодулина в качестве одной из четырех субъединиц фермента. Отсутствие этой субъединицы и обусловливало ферментный дефект, являющийся причиной болезни.

Проведенный выше анализ данных о биологической роли и обмене гликоконъюгатов в норме и при наследственной патологии показывает, насколько быстро и взаимосвязанно развивались исследования в этих областях за последние два десятилетия. Получение новых данных о структуре гликоконъюгатов, ферментах, участвующих в их обмене, а также развитие различных подходов и методов исследования этих биополимеров позволили в сравнительно короткий срок расшифровать причину многих форм патологии на молекулярном уровне. Это, в свою очередь, существенно расширило наши представления о многих биохимических процессах в организме человека в норме. Безусловно, в будущем при исследовании биологической роли и обмена гликоконъюгатов необходимо изучать в тесной взаимосвязи норму и патологию, и именно такой подход, как показано на приведенных примерах, может дать новую информацию, касающуюся разных областей биохимии и молекулярной патологии человека.

НЕФЕРМЕНТАТИВНОЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ

Большинство белков, синтезируемых в организме человека и животных, подвергается посттрансляционному гликозилированию. Условно этот процесс можно разделить на два типа: ферментативный и неферментативный. Первый из них протекает в эндоплазматической сети с участием различных гликозилтрансфераз на этапе процессинга синтезируемых белков и заканчивается образованием «полноценного» гликопротеида; второй представляет собой химическую конденсацию белка и редуцирующего (обладающего восстановительными свойствами) моносахарида и происходит при нормальном функционировании белка в течение всей его «жизни». Классическим примером такого белка, впервые выделенного и охарактеризованного, является гемоглобин А1С (НЬА1С).

В конце 50-х гг. 20 в., когда в клиниках велся усиленный поиск различных вариантов гемоглобина с использованием метода электрофореза, появилось сообщение о так наз. «быстро бегущей» фракции гемоглобина

взрослого человека. Позднее эта фракция была выделена и тщательно исследована. Установлено, что аминокислотный состав ее точно соответствовал составу гемоглобина взрослого человека (НЬА); единственное отличие заключалось в том, что к аминогруппе концевого остатка валина -цепи молекулы гемоглобина был присоединен остаток руктозы. В результате такой модификации изменились не только электрофоретические и хроматографические свойства гемоглобина, но значительно увеличилось его сродство к кислороду, что приводило к ухудшению отдачи кислорода тканям, а также к снижению чувствительности модифицированного гемоглобина к действию его естественного регулятора 2,3-дифосфоглицерата. Сразу же встал вопрос о происхождении связанной с гемоглобином фруктозы и о механизме образования гликозили-рованного ею гемоглобина. В опытах in vitro и in vivo с меченой глюкозой было установлено, что процесс глико-зилирования проходил посттрансляционно и неферментативно и что предшественником фруктозы является глюкоза. Был выяснен и механизм гликозилирования гемоглобина. Оказалось, что НЬА1С представляет собой очень стабильное кетоаминное соединение. Время полу-жизни молекулы НЬА1С составляло 120 дней.

На большом клиническом материале было показано, что при сахарном диабете содержание гликозилированно-го гемоглобина в крови увеличивается в несколько раз по сравнению с нормой. Если у здорового человека гли-козилировано не более 5% гемоглобина, то при длительной некомпенсированной гипергликемии его относительное количество может составлять 15—20% (и выше) всего количества гемоглобина. Было обнаружено, что содержание в крови НЬА1С, а также тяжесть и длительность заболевания сахарным диабетом находятся в прямо пропорциональной зависимости. С момента открытия гликозилированного гемоглобина высказывалась мысль о том, что его появление может служить диагностическим признаком, а относительное содержание — способствовать контролю за эффективностью лечения сахарного диабета. Содержание HbAic в крови является интегральным показателем гликемии за прошедшие 3—4 месяца, на него мало влияют колебания концентрации глюкозы в крови, что очень ценно в диагностическом отношении. Разовое определение концентрации HbAic может заменить такие трудоемкие тесты, как многодневные суточные профили глюкозы крови больных, и такие опасные пробы, как нагрузки глюкозой при сахарном диабете. С помощью этого теста можно отобрать контингент больных, склонных к гипогликемии. Т. о., концентрация в крови HbAic является довольно постоянным показателем. Однако было отмечено, что г ликози лированный гемоглобин состоит из стабильной и лабильной фракции и что при проведении больным нагрузок глюкозой (с последующим хроматографическим определением фракций гемоглобина) происходит резкое повышение, а затем понижение относительного содержания фракций лабильного HbAic. Впоследствии было выяснено, что лабильный HbAic является альдиминовым соединением гемоглобина и глюкозы. Лабильная фракция HbAic составляет примерно 10% всего HbAic, и для ее удаления (чтобы избежать завышения результатов косвенного определения глюкозы) часто используют инкубацию пробы гемоглобина в физиологическом р-ре, диализ или обработку пробы семикарбазидом и анилином. Отделить фракцию стабильного HbAic от фракции лабильного HbAic удалось также с помощью изоэлектрического фокусирования.

До последнего времени остается окончательно не выясненным вопрос, к какому участку молекулы НЬА присоединяется остаток глюкозы при неферментативном гли-козилировании. Появились данные, свидетельствующие о том, что гемоглобин может гликозилироваться по е-аминогруппам нек-рых остатков лизина. Установлено, что наряду с р-валином-1 в молекуле гемоглобина неферментативно гликозилируется также Р-лизин-66, а-лизин-61, р-лизин-17 и а-валин-1 (аминокислотные остатки перечислены в порядке уменьшения их способности к г ликози лированию). Хроматографически от НЬА отделяется только гемоглобин, г ликози лированный по Р-валину-1 (HbAic), однако при использовании более чувствительного метода определения или метода с большей разрешающей способностью (напр., изоэлектрического фокусирования и др.) обнаруживается гетерогенность HbAic, обусловленная полиморфизмом мест гликозилирования. Гетерогенность гликозилированного белка может быть обусловлена также различными изоформами фруктозы, присоединенными кетоаминной связью к гемоглобину. Есть данные, что при сахарном диабете увеличивается содержание всех гликозилированных форм гемоглобина.

На примере HbAic было показано, что вероятность гликозилирования белка зависит от многих факторов, в т. ч. от числа свободных аминогрупп, их стерической (пространственной) доступности, величины константы кислотной диссоциации аминогрупп, продолжительности жизни белка и (особенно) концентрации редуцирующего сахара в среде. В процессе неферментативного гликозилирования могут участвовать все редуцирующие моносахариды, степень их участия определяется содержанием ациклической формы этого сахара.

В результате неферментативного гликозилирования белки могут менять свои функциональные свойства, в т. ч. ферментативную активность, антигенносгь, устойчивость к действию протеолитических ферментов, стереотип своего метаболизма. В результате такого гликозилирования они могут стать патогенными для организма (напр., введение в кровь здоровым собакам гликозилированного HbAic вызывало у них нефропатию). Доказано, что г ликози лирование белков является патогенетическим фактором возникновения диабетической нефропатии, невропатии (поражения периферических нервов), ретинопатии, катаракты, микрососудистых заболеваний и др. Гипергликемия при сахарном диабете и гипергликемия другого происхождения может также способствовать локальному накоплению в тканях фосфорилирован-ных сахаров, к-рые способны активно участвовать в неферментативном гликозилировании.

В норме и особенно при сахарном диабете, галактозе-мии и др. неферментативному гликозилированию подвергаются как внеклеточные, так и клеточные белки, гл. обр. те, к-рые непосредственно контактируют с сахарами, содержащимися в крови. Из внеклеточных белков наиболее исследованы различные гемоглобины, белки сыворотки крови и коллагена, из клеточных — белки мембран эритроцитов, миелиновой оболочки нейронов, кристаллин (главный белок хрусталика глаза).

Аналогично НЬА неферментативно гликозидируются и другие виды гемоглобина (напр., гемоглобипы F и S). Из белков сыворотки крови наиболее подвержены неферментативному гликозилированию альбумины и в меньшей степени — ai-глобулины. Установлено, что если в сыворотке крови здорового человека содержится от 6 до 15% гликозилированного альбумина, то при сахарном диабете его содержание увеличивается в 2—4 раза. Гликозилирование молекулы альбумина происходит чаще всего по остатку лизина в 189-м положении. Содержание гликозилированного альбумина коррелирует с концентрацией HbAic, но образуется он значительно быстрее, чем HbAic, и быстрее обменивается в организме (время полужизни альбумина 20 дней). Концентрация гликозилированного альбумина служит информативным показателем содержания глюкозы в крови в течение истекших 4—6 дней и является хорошим индикатором для контроля за ходом лечения сахарного диабета.

Основной белок соединительнотканных волокон — коллаген богат остатками лизина и оксилизина, к-рые подвергаются неферментативному гликозилированию. При сахарном диабете концентрация гликозилированного коллагена, напр, в стенке аорты и в базальных мембранах почечных клубочков, увеличивается более чем в 2 раза. Гликозилирование коллагена мешает нормальной поперечной «сшивке» коллагеновых волокон, снижает их эластичность и может привести к функциональным нарушениям, обусловленным неполноценностью соединительнотканных элементов и наблюдаемым, наир., при сахарном диабете, старении организма.

На клиническом материале (особенно при сахарном диабете) было показано, что при длительной гипергликемии снижается эластичность мембраны и уменьшается срок жизни эритроцитов. В основе патогенеза этих явлений лежит неферментативное гликозилирование белков мембран эритроцитов. Количество гликозилированных белков мехмбран эритроцитов при сахарном диабете увеличивается в 2—3 раза по сравнению с нормой. Обнаружено, что белки базальной мембраны нервных волокон содержат г ликози льные остатки; при диабете их количество может возрастать в 2—6 раз по сравнению с нормой, в результате чего снижается скорость проведения нервного импульса, происходит демиелинизация нервных волокон, развивается так наз. диабетическая невропатия.

Одним из существенных диагностических признаков галактоземии и длительного плохо леченного сахарного диабета является развитие катаракты. В опытах in vitro обнаружено, что белок хрусталика кристаллин способен неферментативно гликозилироваться, причем повышается чувствительность этого белка к действию веществ — окислителей сульфгидрильных групп, что приводит к образованию поперечных дисульфидных «сшивок» в молекулах кристаллина. В результате образуются высокомолекулярные агрегаты. Криста ллин в агрегированном состоянии теряет свою прозрачность и растворимость. Таков предположительный патогенез катаракты на молекулярном уровне. Предотвратить этот процесс или даже сделать обратимым помутнение кристаллина в принципе можно с помощью соединений, восстанавливающих сульфгидри льные группы (2-меркаптоэтанола, дитио-эритритола и др.) или препаратов, блокирующих сульф-гидрильные группы. При исследовании кристаллина, выделенного из помутневшего хрусталика при катарактах различного происхождения (диабетической, галак-тоземической или старческой), было показано, что во всех случаях этот белок был гликозилирован, и степень его гликозилированности во много раз превышала норму. Следовательно, неферментативное гликозилирование может быть причиной возникновения катаракты.

Любое аминосодержащее соединение, подвергшееся неферментативному г ликози лнрованию, способно к дальнейшим модификациям — полимеризации, внутримолекулярным перестройкам и др., в результате чего образуются высокомолекулярные соединения, окрашенные в желтый или коричневый цвет. Этот процесс получил название реакции «неферментативного побурения белков», или реакции Майяра. Реакция Майяра чрезвычайно распространена, она происходит не только при тепловой стерилизации пищевых продуктов, при приготовлении пищи или при длительном ее хранении, но и при долгом хранении гликозилированных белков in vitro, в физиологических условиях происходит in vivo с долгоживущими белками. По мнению нек-рых исследователей, неферментативное гликозилирование и последующие этапы реакции Майяра для долгоживущих белков в организме человека и животных являются нормальными возрастными процессами и служат одним из признаков старения организма, однако при нек-рых нарушениях углеводного обмена (при сахарном диабете, галактоземии и др.) ускоряется течение и увеличивается объем реакции Майяра.

Для изучения проблемы неферментативного гликози-лирования белков большое значение имеет выбор метода исследования. Однако пока еще не предложено простого, достаточно надежного и точного метода определения кетоаминных соединений. Настойчивые поиски в этом направлении продолжаются во многих лабораториях мира. Наиболее распространенными методами определения неферментативно гликозилированных белков сейчас являются методы электрофореза на различных носителях, изоэлектрофокусирование, различные виды хроматографии, иммунологические методы, химические методы, основанные на гидролизе кетоаминной связи и последующем определении образовавшегося кетосахара.

Необходимо отметить, что в настоящее время исследуются главным образом белки, содержание к-рых в тканях весьма высоко и срок биологической жизни достаточно велик. Именно на их примере было показано, как гликозилирование меняет функции и свойства белков. Однако неферментативному гликозилированию при гипергликемии подвергаются и быстро обменивающиеся белки, такие как гормоны, ферменты, липопротеиды, физиологически активные пептиды, аминокислоты. Начавшиеся исследования этих веществ показали, что при гликозилировании они тоже меняют свои свойства и функции. Дальнейшие работы в этой области биохимии помогут уточнить патогенез таких заболеваний, как сахарный диабет и галактоземия, а также осветить нек-рые стороны сложного процесса старения организма. Определение относительного и абсолютного содержания гликозилированных белков, пептидов и аминокислот позволит с высокой степенью достоверности диагностировать такие заболевания, в к-рых молекулярным патогенетическим механизмом на самых ранних стадиях болезни является неферментативное гликозилирование, а содержание гликозилированных соединений в крови уже в ближайшее время станет специфическим показателем успешности проводимого лечения.

Библиогр.: Роль протеолитических ферментов в регуляции

физиологических процессов и их значение для медицины — К у-с е н ь С. И. и С т о й к а Р. С. Молекулярные механизмы в действии полипептидных факторов роста, М., 1985, библиогр.; ЛокшинаЛ. А. Регуляторная роль протеолитических ферментов, Молек. биол., т. 13, в. 6, с. 1205, 1979; О г л о б л и н а О. Г. Роль протеиназ гранулоцитов и их ингибиторов в патогенезе неспецифических эндобронхитов, Вопр. мед. хим., т. 30, в. 1, с. 3, 1984; О ре хо вич В. Н. и др. Роль протеолитических ферментов в регуляции физиологических процессов, Вестн. АМН СССР, № 8, с. 3, 1984; Хорст А. Молекулярные основы патогенеза болезней, пер. с польск., М., 1982; Coletti-Pre-

V i е г о М. А. а. о. Molecular diseases of limited proteolysis, Clin. Biochem., v. 12, p. 284, 1979; D e W i e d D. Neuropeptides and psychopathology, Europ. J. clin. Invest ., v. 12, p. 281, 1982; Loh Y. P., Bro wnstein M. J. a. Gainer H. Proteolysis in neuropeptide processing and other neural functions, Ann. Rev. Neurosci., v. 7, p. 189, 1984; Proteases: Potential role in health and disease, ed. by W. H. Horl a. A. Heidland, N. Y., 1984; Proteinases and tumor invasion, ed. by P. Strauli а. о., N. Y., 1980; Tumor invasion and metastasis, ed. by L. A. Liotta a. I. R. Hart, The Hague a. o., 1982.

Новое в проблеме регуляции: регуляторная функция сердца — С a m a r g о М. J. F. а. о. Calcium-dependent hemodynamic and natriuretic effects of atrial extract in isolated rat kidney, Amer. J. Physiol., v. 246, p. F 447, 1984; С o g a n M. G. Atrial natriuretic factor ameliorates chronic metabolic alkalosis by increasing glomerular filtration, Science, v. 229, p. 1405, 1985; Currie M.G. a. o. Bioactive cardial substances: potent vasorelaxant activity in mammalian atria, ibid., v. 221, p. 71, 1983; Currie M. G. a. o. Purification and sequence analysis of bioactive atrial peptides (atriopeptins), ibid., v. 223, p. 67, 1984; Greenberg B. D. a. o. Nucleotide sequence of the gene encoding human atrial natriuretic factor precursor, Nature (Lond.), v. 312, p. 656, 1984; G u t k о w-s k a J. a. o. Atrial natriuretic factor is a circulating hormone, Biochem. biophys. Res. Commun., v. 125, p. 315, 1984; Hart-ter E. a. o. Atrial natriuretic peptide concentrations in blood from right atrium in patient with severe right heart failure, Lancet, v. 2, p. 93, 1985; KuribayashiT. a. o. Renal effect of human-a-atrial natriuretic polypeptide, New Engl. J. Med., v. 312, p. 1456, 1985; Lang R. E. a. o. Atrial natriuretic factor — a circulating hormone stimulated by volume loading, Nature (Lond.), v. 314, p. 264, 1985; L a z u r e C. a. o. Atrial pronatriodilatin a precursor for natriuretic factor and cardiodilatin, Amino acid sequence evidence, FEBS Letters, v. 172, p. 80, 1984; M i s o n о K. S. a. o. Rat atrial natriuretic factor: complete amino acid sequence and disulfide linkage essential for biological activity, Biochem. biophys. Res. Commun., v. 119, p. 524, 1984; Mi so no K. S. a. o. Rat atrial natriuretic factor, isolation, structure and biological activities of four major peptides, ibid., v. 123, p. 444,1984; Nakaoka H. a. o. Plasma levels of atrial natriuretic factor in patients with congestive heart failure, New Engl. J. Med., v. 313, p. 892, 1985; R i-c h a r d s A. M. a. o. Renal, hemodynamic, and hormonal effects of human alpha atrial natriuretic peptide in healthy volunteers, Lan-

cet, v. 1, p. 545, 1985; Samson W. K. Atrial natriuretic factor inhibits dehydratation and hemorrage-induced vasopressin release, Neuroendocrinology, v. 40, p. 277, 1985; S a p e г С. B. a. o. Atriopeptin — immunoreactive neurons in the brain: presence

in cardiovascular regulatory areas, Science, v. 227, p. 1047, 1985; Sonnenberg H. Atrial natriuretic factor — a new hormone affecting kidney function, Klin. Wschr., S. 886, 1985; Tikka-n e n I. a. o. Plasma atrial natriuretic peptide in cardiac disease and during infusion in healthy volunteers, Lancet, v. 2, p. 66, 1985; WinquistR. J. a. o. Atrial natriuretic factor elicits and endothelium — independent relaxation and activates particulate guany-late cyclase in vascular smooth muscle, Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.), v. 81, p. 7661, 1984; Z i v i n R. A. a. o. Molecular cloning and characterization of DNA sequences encoding rat and human atrial natriuretic factors, ibid., p. 6325.

Биосинтез белков межклеточного вещества и проблемы опухолевого роста — Берман А. Е. Особенности биосинтеза белков экстрацеллюлярного матрикса при опухолевом росте, Биохимия, т. 50, в. 11, с. 1763, 1985; Cell biology of extracellular matrix, ed. by E. D. Hay, N. Y.— L., 1983; Keski-Oja J.,Rapp U.R. a. V a h e r i A. Transformation of MMC-E epithelial cells by acute 36II-MSV: inhibition of collagen synthesis and induction of novel polypeptides, J. cell. Biochem., v. 20, p. 139, 1982; M u t о М. a. о. Cellular transformation and differentiation, Effect of Rous sarcoma virus transformation on sulfated proteoglycan synthesis by chicken chondrocytes, Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.), v. 74, p. 4173, 1977; Smith B. D. a. Niles R. Characterization of collagen synthesized by normal and chemically transformed rat liver epithelial cell lines, Biochemistry, v. 19, p. 1820, 1980; S o b e 1 M. R. a. o. Regulation of procollagen messenger ribonucleic acid levels in Rous sarcoma virus transformed chick embryo fibroblasts, ibid., v. 20, p. 2678, 1981; Y a m a g a t a S. a. o. FBJ-virus-induced osteosarcoma has type Y collagen consisting of A, В and С — like chains in addition to type I collagen, Biochem. biophys. Res. Com-mun., v. 105, p. 1208, 1982; Yoshimura М., Jime

nez S. A. a. К a j i A. Effects of viral transformation on synthesis and secretion of collagen and fibronectin — like molecules by embryonic chick chondrocytes in culture, J. biol. Chem., v. 256, p. 9111, 1981.

Достижения в области биохимии биогенных аминов — Андреева Н. И., Горкин В.З. и Машко вский М. Д. Новое в изучении антидепрессантов-ингибиторов МАО, Хим.-фарм. журн., т. 19, № 6, с. 650, 1985, библиогр.; Васильев В. Н. и Чугунов В.С. Симпатико-адреналовая активность при различных функциональных состояниях человека, М., 1985,

библиогр.; Веревкина И. В. и др. Избирательное ингибирование пиразидолом моноаминоксидаз типа А в различных тканях человека и животных, Вопр. мед. хим., т. 29, в. 5, с. 118, 1983; Горкин В.З. Научно-техническая революция в области биохимии аминов и ее социальные аспекты, там же, в. 4, с. 2; он же, Метаболизм биогенных моноаминов при патологических состояниях ЦНС, Нейрохимия, т. 4, № 1, с. 68, 1985; М о с к в и-т и н а Т. А. и др. Моноаминоксидаза мозга при шизофрении, Бюлл. эксперим. биол. и мед., т. 99, № 6, с. 671, 1985; В е у Р. а. о. (E)-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-3-fluoroallylamine: a selective, enzyme-activated inhibitor of type В monoamine oxidase, J. Med. Chem., v. 27, p. 9, 1984; Denney R. M. a. o. Human liver MAO-A and MAO-B separated by immunoaffinity chromatography with MAO-B-specific monoclonal antibody, Science, v. 215, p. 1400, 1982; Denney R. M. a. o. Use of a monoclonal antibody for comparative studies of monoamine oxidase В in mitochondrial extracts of human brain and peripheral tissues, Molec. Pharmacol., v. 24, p. 60, 1983; Knoll J. Selective inhibition of В type monoamine oxidase in the brain: a drug strategy to improve the quality of liie in senescence, Strategy drug Res., v. 4, p. 107, 1982; Lieb J. Remission of rheumatoid arthritis and other disorders of immunity in patients taking monoamine oxidase inhibitors, Int. J. Immunopharmacol., v. 5, p. 353, 1983; Patel N. Т., Fritz R. R. a. A b e 11 C. W. Isolation of pure, catalytically active human liver monoamine oxidase B: antibody complex, Biochem. biophys. Res. Commun, v. 125, p. 748, 1984; Pearce L. B. a. R o t h J. A. Monoamine oxidase: separation of the type A and В activities, Biochem. Pharmacol., v. 33, p. 1809, 1984; Y а с с a г о К. К. a. о. Monensin inhibits catecholamine synthesis in pheochromocytoma cells, J. Pharmacol. exp. Ther., v. 221, p. 536, 1982.

Успехи и перспективы биологической и медицинской химии углеводсодержащих биополимеров — Видершайн Г. Я. Углеводсодержащие биополимеры в процессах узнавания молекул и клеток, в кн.: Усп. биол. хим., под ред. Б. Н. Степаненко, т. 20, с. 46, М., 1979; он же, Биохимические основы гликозидозов, М., 1980; Лизосомы и лизосомные болезни накопления, под ред. Дж. В. Каллахана и Дж. А. Лоудсна, пер. с англ., М., 1984; Розенфельд Е.Л. Особенности биохимических нарушений при наследственных энзимопатиях у человека и животных, Вопр. мед. хим., т. 28, в. 3, с. 2, 1982; Хьюз Р. С. Гликопротеины, пер. с англ., М., 1985; Цветкова И. В. О пренатальной диагностике наследственных энзимопатий, Вестн. АМН СССР, № 8, с. 70, 1984.

Неферментативное гликозилирование белков — Bunn H. F. а. о. Structural heterogeneity of human hemoglobin A due to non-enzymatic glycosylation, J. biol. Chem., v. 254, p. 3892, 1979; G a j d о s A. Les h£moglobines glycolys6es, Leur importance chez le diab6tique, Nouv. Presse m6d., t. 8, p. 2613, 1979; G a r e 1 M.C. a. o. HbAlc: a review on its structure, biosynthesis, clinical significance and methods of assay, Biomedicine, v. 30, p. 234, 1979; Guthrow C.E. a.o. Enhanced nonenzymatic glycosylation of human serum albumin in diabetes mellitus, Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.), v. 76, p. 4258, 1979; M a q u a r t F. X. e. a. L’h6moglo-bine Ale: un nouvel Element de surveillance du diabfcte, Ann. Biol, clin., t. 36, p. 467, 1978; Miller J. A., GravalleseE.a. Bunn H. F. Nonenzymatic glycosylation of erythrocyte membrane proteins, Relevance to diabetes, J. clin. Invest., v. 65, p. 896, 1980; Sasaki J., Arora Y. a. Cottam G. L. Nonenzymatic galactosylation of human LDL decreases its metabolism by human skin fibroblasts, Biochem. biophys. Res. Commun., v. 108, p. 791, 1982, Schlebusch H., Sorger M. u. Burisch H. Vergleich verschiedener Methoden zur Bestimmung glykosylierter Hamoglobine, Klin. Wschr., S. 787, 1984; S c h n i d e r S. L. a. К o h n R. R. Glycosylation of human collagen in aging and diabetes mellitus, J. clin. Invest., v. 66, p. 1179, 1980; Shapiro R. a. o. Sites of nonenzymatic glycosylation of human hemoglobin A, J. biol. Chem., v. 255, p. 3120, 1980; Stevens Y. J. a. o. Diabetic cataract formation: potential role of glycosylation of lens crystalline, Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.), v. 75, p. 2918, 19 78; W i d n e s s J. A. a. o. Rapid fluctuations in glycohemoglobin (hemoglobin Ale) related to acute changes in glucose, J. Lab. clin. Med., v. 95, p. 386, 1980.