ДИССОЦИАЦИЯ БАКТЕРИЙ

ДИССОЦИАЦИЯ БАКТЕРИЙ (лат. dissociatio разделение, разъединение) — возникновение в популяции бактерий особей, дающих начало новым клонам, отличающимся от исходного типа внешним видом и структурой колоний, а также наследственно закрепленными изменениями некоторых морфол., физиол, и биохим, признаков. При этих изменениях основные таксономические характеристики данного вида обычно сохраняются.

Термин «диссоциация» в микробиологии впервые применил де Крюи (P. de Kruif, 1921), наблюдавший расщепление культуры возбудителя кроличьей септицемии на вирулентные и авирулентные варианты. Аркрайт (J. Arkwright, 1921) установил у бактерий родов Shigella (см.) и Salmonella (см.) различия диссоциативных форм по характеру колоний, последовательности возникающих изменений на плотных и жидких питательных средах, изменения антигенных свойств и вирулентности.

Диссоциация известна у многих видов бактерий, а также у грибков, дрожжей, водорослей. Обычно она выявляется в стареющих культурах, при субоптимальных условиях развития данного вида микроорганизмов. Наиболее полно процесс диссоциации изучен при культивировании бактерий в искусственной среде. Д. б. возникает и в природных условиях (у патогенных бактерий в живом организме) под влиянием бактериофагов, продуктов метаболизма, отклонений от оптимальных значений pH, повышенной концентрации солей, неоптимальной температуры, специфических антимикробных сывороток и др.

В условиях эксперимента Д. б. можно вызвать (или интенсифицировать ее фенотипическое выражение) воздействием мутагенов (см.) — ионизирующих излучений, производных иприта, ДНК-тропных препаратов и др.

Признаком Д. б., доступным наблюдению, является изменение морфологии колоний на плотной питательной среде. Эти изменения типичны для филогенетически родственных групп микроорганизмов и, как правило, необратимы. Обычно за норму принимают характер роста культуры при рассеве на плотной среде в виде блестящих, гладких колоний маслянистой консистенции — S-формы (англ. smooth гладкий), в отличие от шероховатых или складчатых R-колоний (англ. rough грубый, шероховатый), характеризующих резко выраженный процесс диссоциации. Структурные различия этих основных типов колоний, наблюдающихся при диссоциации большинства бактерий, определяются физ.-хим. факторами (состав среды, условия роста и развития), а также особенностями измененных клеток, при делении различно перемещающихся относительно друг друга. В зависимости от типа деления и силы сцепления клеточных элементов проявляется рыхлость строения и мутантность поверхности колоний у R-вариантов (табл.). Типы деления клеток изучены при помощи цейтрайферной киносъемки (см. Кинематография в медицине) у развивающихся колоний кишечных бактерий (В. Л. Троицкий и 3. Г. Першина). Для гладких S-коло-ний характерен «скользящий» тип деления, при к-ром новые клетки плотно прилегают одна к другой и как бы скользят вдоль формирующихся тяжей из разделившихся, но не разомкнувшихся особей (рис. 1).

R-колонии образуются при замедленном разделении укрупненных клеток, складывающихся в виде неэластичных цепочек, при скоплении в популяции дающих характерные «изломы», что отражается и на особенностях макроструктуры колоний (рис. 2). Диссоциированную культуру легко отличить и по росту в жидкой питательной среде. Для гладкой формы типично равномерное помутнение среды, за к-рым следует образование вязкого осадка, при встряхивании поднимающегося в виде косы; развитие в жидкой среде шероховатой формы бактерий характеризуется образованием крошковатого придонного осадка и иногда такого же пристеночного роста; среда при этом остается прозрачной, а на поверхности может образоваться пылевидная, а затем морщинистая пленка.

При суспендировании в физиол, р-ре диссоциированных бактерий, выросших на плотной среде, также выпадает крошковатый осадок, особенно интенсивный при нагревании суспензии.

Представления о S-формах как о нормальных, типичных и R-формах— как о неполноценных, дегенеративных применимы не ко всем видам бактерий. Так, для микобактерий туберкулеза, бацилл сибирской язвы, картофельной и сенной палочек, так же как для многих видов грибков, нормальным является шероховатая структура колоний на плотной среде и соответствующий тип роста в жидкой среде, остающейся прозрачной.

В процессе диссоциации у большинства патогенных микроорганизмов снижается токсичность или вирулентность. Однако бывают исключения. Так, напр., у стрептококков наблюдаются обратные соотношения. Вирулентными оказываются матовые, неблестящие колонии, для которых предложен термин «mat», и авирулентными — блестящие, гладкие [«glossy» по Тодду и Лансфилд (E. W. Todd, R. S. Lancefield, 1928)].

У многих бактерий известна промежуточная форма колоний между S и R — слизистая, М-форма (англ. mucoid), однако она нестабильна. Для некоторых видов бактерий, кроме названных, применяются также обозначения: D — карликовая форма (англ. dwarf карлик) и G — гонидиальная форма (англ. gonidial).

По типу изменений соматического (О) и жгутикового (Н) антигенов диссоциированных форм применяются также обозначения типов колоний О и H или переходного — ОН. В соответствии с общепринятыми обозначениями типов колоний общеприняты следующие характеристики их: S-форма — круглые, выпуклые, с ровным краем (рис. 3), прозрачные или опалесцирующие в проходящем свете, гомогенные, с блестящей поверхностью; R-форма — более плоские колонии, часто неправильной формы с бахромчато-извилистым краем и складчатой «гирозной» поверхностью (рис. 4 и 5); М-форма — влажные, слизистые колонии, часто окаймленные слизистым валиком (рис. 6), сливающимся затем в общую массу вязкой консистенции, тянущуюся за движением платиновой петли. D- и G-формы по внешней характеристике идентичны. Это очень мелкие, карликовые, колонии, развивающиеся нередко в виде так наз. дочерних новообразований преимущественно по краю нормально развитых колоний или изолированно от них (рис. 7). В последующих генерациях при оптимальных условиях культивирования они постепенно укрупняются до нормальной величины и приобретают форму, типичную для данного вида бактерий.

Изменения внешнего вида колоний не всегда свидетельствуют об истинной диссоциации; они могут быть следствием изменения состава питательной среды и других факторов, отклоняющих условия культивирования от оптимальных и ведущих к временным модификациям, исчезающим при культивировании в нормальных условиях.

Для дифференцирования S- и R-диссоциативных форм бактерий применяют трипафлавиновую пробу Пампаны. Ее проводят по типу капельной агглютинации (см.) на предметном стекле, на к-рое наносят р-р трипафлавина (1 : 1000—1 : 2000); в нем суспендируется взвесь микробов в 0,9% изотоническом р-ре хлорида натрия. Микробы, находящиеся в R-форме, склеиваются, образуют конгломераты, подобно агглютинации специфической сывороткой, просветляя р-р красителя. S-микробные клетки образуют гомогенную мутную взвесь. Для дифференцирования диссоциативных форм бактерий в микрокультурах Ульбрих (F. Ulbrieh, 1957) предложил прижизненную окраску кристалл-виолетом в разведении 1 : 2000. При обработке в течение 20 сек. S- и R-варианты воспринимают краситель различно.

Изменение культуральных, физиол ., физ. -хим., адсорбционных свойств диссоциированных бактерий связано с особенностями полисахаридолипоидных компонентов микробных клеток, составляющих «полный антиген» по Буавену, или соматический О-антиген. В нормальном состоянии эти компоненты легко обнаруживаются у гладких вариантов большинства грамотрицательных и многих грамположительных бактерий и не выявляются у R-вариантов. Основными свойствами полных (О) антигенов у патогенных микробов являются высокая специфичность и токсичность, связанные с вирулентностью, токсигенностью и способностью стимулировать выработку специфических антител при иммунизации животных. Потеря вирулентности и атоксичность R-вариантов связывается с утратой или извращением способности синтеза липополисахаридов. Относительное увеличение белковых компонентов при редуцировании полисахаридолипоидных обусловливает повышенную гидрофобноcть микробных клеток и склонность их к выпадению в осадок из солевых р-ров при нагревании или в присутствии некоторых основных красителей.

Те же изменения физ.-хим. свойств поверхностных компонентов микробной клетки приводят к утрате специфической агглютинабельность! R-форм бактерий и замене ее «серологическим космополитизмом»— термин, введенный Шютце (R. Schutze, 1922) в отношении сальмонеллезных бактерий. Сущность его заключается в том, что R-культура в начальном периоде развития агглютинируется почти до титра сыворотками R-типа других родственных видов и не агглютинируется S-антисы-воротками тех же микробов. Утрата видовой серол, специфичности молодых культур и спонтанная агглютинабельность старых не позволяют использовать серол, тесты для идентификации диссоциированных форм бактерий.

Однако при Д. б. основные сахаролитические свойства (ферментация углеводов), морфол, и тинкториальные характеристики, как правило, сохраняются без изменений, хотя возможны и исключения. Так, известны факты повышения ферментативной активности R-форм уксуснокис лых бактерий и изменение свойств у некоторых продуцентов антибиотиков.

В смешанных S — R-популяциях и чистых линиях R-вариантов бактерий возможны реверсии в исходную S-форму, происходящие с различной частотой. Генетическая природа диссоциативного процесса связана с хромосомными мутациями генов (см. Мутация), контролирующих синтез специфических антигенов. На сальмонеллезных бактериях удалось провести генетический анализ структуры детерминант соматического антигена [Стокер (В. A. D. Stocker) и соавт., 1971]. При помощи серии мутантов, имеющих повреждения в различных локусах хромосомы, картированы гены, ответственные за синтез компонентов, составляющих структуру ядра соматического антигена, контролирующие синтез боковых цепей полисахаридной природы, характер и длина которых определяют способность к специфической агглютинации. Так. при наличии мутации в локусе rfa полностью утрачивается способность синтеза соматического антигена; мутация в локусе rfb ведет к утрате синтеза боковых цепей при сохранении компонентов ядра соматического антигена; мутации типа rfc выражаются в образовании клеток промежуточной S —R-формы, О-антиген которых содержит нормальное ядро и короткие полисахаридные цепочки; за счет последних может осуществляться специфическая агглютинация.

Теоретические обоснования циклического развития и закономерной смены фаз диссоциации — теория циклогении по Хедли — представляют исторический интерес, хотя фактические данные и детальное описание фенотипического выражения изменений микробных популяций, связанных с процессом диссоциации, не утратили своего значения (см. Бактерии, физиология). Наблюдавшееся спонтанное восстановление R-форм популяции в исходную S-форму сторонники теории цикло-гении рассматривали в качестве физиол. нормального цикла развития через промежуточные фазы — S—О—M—R—S (по М. И. Штуцеру, 1930). Исследователи, применявшие в качестве критерия оценки Д. б. изменения в антигенном строении, связанном с утратой полисахаридолипоидных компонентов, считали переход из S- в R-форму необратимым. Объективно частичная или полная реверсия в исходное S-состояние — процесс закономерный; он может быть в определенных условиях стимулирован. Так, показана возможность реверсии R-вариантов в S-фор-мы при выращивании бактерий на средах, содержащих убитые S-бактерии, или при введении смеси S- и R-форм в организм лабораторного животного. На тип изменений в свойствах бактерий при диссоциации могут влиять накапливающиеся в среде метаболиты, угнетающие развитие нормальных форм и стимулирующие рост R-вариантов, менее чувствительных или резистентных к действию этих метаболитов. Примером может служить влияние D-аланина, способствующего развитию R-вариантов бруцелл, резистентных к действию его высоких концентраций, и значение валина, способствующего развитию мукоидных форм тех же .бактерий. В присутствии гликокола, лейцина большинство R-клеток популяции В. brevis (вариант G—В) трансформмировалось в S-форы. Наличие в синтетической среде валина способствовало процессу диссоциации бактерий того же вида (Г. Г. Жарикова и др., 1971). Важным фактором, направляющим процесс диссоциации в условиях лабораторного культивирования бактерий, является селекционирующее влияние среды, изменяющейся в зависимости от особенностей метаболизма определенных групп микроорганизмов и интенсивности обмена на разных этапах развития микробной популяции.

Правильное представление о Д. б. имеет практическое значение для предотвращения дегенеративных изменений в свойствах ценных типовых культур или штаммов продуцентов в производстве бактерийных препаратов, поэтому основные признаки, характеризующие бактерии в S- и R-формах, сохраняют значение. Кроме различий, указанных в таблице, R-формы кишечных бактерий отличаются от S-форм большей устойчивостью к УФ-лучам, выраженными антикомплементарными свойствами (см. Комплемент) и высокой резистентностью к бактериолизинам нормальной сыворотки крови. Степень и характер диссоциативных изменений популяции бактерий могут быть определены с использованием современных методов генетического анализа мутационных изменений и их фенотипической экспрессии. Феноменологические данные и микробиол, тесты идентификации основных диссоциативных форм бактерий сохраняют свое значение при диагностических исследованиях.

См. также Изменчивость, бактерий.

Таблица. Основные признаки диссоциированных бактериальных культур в S- и R-фазах по Хедли (P. HADLEY)

S-нормальный тип	R-мутантный тип
Гомогенный рост в бульоне	Агглютинативный рост в бульоне
Нормальная суспензия в 0,9% р-ре NaCl	Выпадение осадка в 0,9% р-ре NaCl
Ограниченный рост на агаре	Часто расползающийся рост на агаре
Колонии гладкие, правильной формы, выпуклые	Колонии шероховатые, неправильной формы, плоские
Может давать дочерние колонии	Дочерние колонии возникают редко
Рост на агаре сочный	Рост на агаре плотнее
Рост на агаре флюоресцирующий	Рост на агаре редко флюоресцирующий
Рост на агаре пигментирующий	Рост на агаре непигментирующий
Подвижность активная у подвижных организмов	Подвижность исчезает
Капсулы у капсулообразователей	Капсулы отсутствуют
Биохимически более активны	Биохимически менее активны
Носители двойных антигенов	Часто только R-антигены
Обладают специфическим растворимым веществом	Не обладают специфическим растворимым веществом
Агглютинация в форме выпадения хлопьев, зерен	Мелкозернистая агглютинация
В случае патогенных бактерий более вирулентны или токсичны	Слабо вирулентны или совсем невирулентны
Чаще встречаются в течение активного заболевания	Больше встречаются у носителей и выздоравливающих
Чаще встречаются при остром течении болезни	Чаще встречаются при хроническом течении болезни
Погибают в старых культурах	Устойчивы в старых культурах
Чувствительны к бактериофагу	Менее чувствительны к бактериофагу
Свободноживущие формы	Результат приспособляемости
Клетки нормальной морфологии	Наклонность к образованию коротких палочек и кокков
Переход в О- и R-форму в S-иммунной сыворотке	Не изменяются в S-иммунной сыворотке
Резистентен к фагоцитозу	Поддаются фагоцитозу

Библиография: Готовцева В. А., Гусакова Е. Г. и Коровкина А. С. О диссоциации культуры Mycobacterium globiforme 193 на S- и R-формы, Микробиология, т. 37, в. 3, с. 505, 1968; Ш а-р и к о в а Г. Г. и МаркеловаС. И. Диссоциация R и Р + вариантов В. brevis var. G В при развитии на синтетической среде с аминокислотами в качестве единственного источника азота, Антибиотики, т. 16, № 3, с. 265, 1971; Штуцер М. И. Очерк учения о диссоциации и цикле развития бактерий, Журн. микр. и иммун., т. 7, в. 2, с. 129, 1930, библиогр.; BertschingerH. U. Disso-ziationsbedingte serologische Kreuzreak-tionen bei Schweine-Enterotoxamia-Koli-typen, Path, et Microbiol. (Basel), Bd 36, S. 215, 1971; B i s s e t K. A. a. S t r e-e t J. Morphological phases in the swarm of bacillus licheniformis, J. gen. Microbiol., v. 76, p. 369, 1973; H a d 1 e у P. Micro-bis dissociation, J. infect. Dis., v. 40, p. 1, 1927.

Д. Г. Кудлай.