ГИБРИДОМА • Med-of-Rita

Гибридома (лат. hibrida, hybrida помесь + -oma) — злокачественная клетка, полученная путем слияния (гибридизации) опухолевой клетки с ее нормальным аналогом, унаследовавшая от злокачественной клетки способность к неограниченному росту,а от нормальной клетки способность к синтезу специфического белка, чаще всего антитела.

Впервые в 1975 г. Кёлер (G. Kohler) и Милстайн (С. Milstein) показали, что индивидуальные клоны (см. Клон) антителосекретирующих клеток могут быть превращены в бессмертные при слиянии с миеломными клетками. В результате возникает линия злокачественных клеток, способных к бесконечному росту в культуре или в организме и продуцирующих антитела (см.) заданной специфичности.

Спонтанное слияние клеток происходит исключительно редко. Однако практически любые клетки можно слить, используя парагриппозный вирус Сендай, а также лизолецитин или полиэтиленгликоль. Слияние клеток с образованием общей клеточной оболочки приводит к возникновению так наз. гетерокариона — клетки с двумя или более ядрами, к-рые сливаются, объединяя свои хромосомные наборы и образуя гибридную клетку (см. Генетика соматических клеток). Слияние ядер, даже под действием полиэтилен-гликоля происходит не часто. С помощью специальной культуральной среды неслившиеся клетки элиминируются, и культура клеток (см. Культуры клеток и тканей) через нек-рое время после гибридизации (см.) состоит практически только из гибридных клеток. Поэтому для получения Гибридомы важно создать селективные питательные среды, обеспечивающие рост только гибридных клеток. Теоретической основой метода селекции является следующее. Главный путь биосинтеза пуринов и пиримидинов может быть блокирован антагонистом фолиевой к-ты аминоптерином. В этом случае клетка может синтезировать ДНК побочным путем, зависящим от ферментов тимидинкиназы (КФ 2.7.1.21) и гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (КФ 2.4.2.8), способных обеспечить пролиферацию клетки в присутствии тимидина и гипоксантина. При отсутствии одного из этих ферментов синтез ДНК прекращается. Клетка может избежать этого путем слияния с другой клеткой, способной снабдить ее недостающим ферментом. Т. о., если добиться слияния нормальной клетки селезенки, к-рая обладает активностью тимидинкиназы и гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы с миеломной клеткой, лишенной активности этих ферментов и потому погибающей при культивировании на среде с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (так наз. ГАТ-среда), в культуре клеток будут размножаться только гибридные клетки.

Получен ряд линий мутантных миеломных клеток, лишенных активности гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы. Отбор мутантов довольно прост, т. к. цитостатики типа тиогуанина или азагуанина включаются в молекулу ДНК с помощью этого фермента; поэтому в присутствии азагуанина в культуре выживают только мутантные клетки. Синтез гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы кодируется геном, расположенным на Х-хромосоме. В клетках млекопитающих активна только одна Х-хромосома, поэтому единственной мутации достаточно для полного прекращения синтеза фермента. Отобрать клетки-мутанты, лишенные тимидинкиназы, существенно сложнее, т. к. для этого требуется наличие двух редких мутаций одновременно.

Для того, чтобы гибридная клетка могла проявить себя как функционально дифференцированная клетка, обе родительские клетки должны находиться на примерно одинаковых стадиях дифференцировки, в противном случае гибридная клетка быстро теряет эту способность. Поэтому для получения Гибридом, способных секретировать антитела, нормальные антител ©секретирующие клетки (В-лимфоциты) сливают только с миеломными клетками (для облегчения отбора нужных клонов используют мутантные миеломные клетки, не только лишенные гипоксантин-фосфори-бозилтрансферазы, но и не секретирующие иммуноглобулины). Для получения Г., сохраняющих функцию Т-лимфоцитов (см. Иммунокомпетентные клетки), последние сливают с мутантными клетками тимомы. Г. клеток печени получают слиянием нормальных клеток эмбриональной или взрослой печени с мутантными клетками гепатомы и т. д. Однако наиболее широко используют Г., секретирующие антитела. Чаще всего в качестве источника родительских клеток берут клетки мыши или крысы. Межвидовые гибриды не стабильны, т. к. хромосомы, несущие гены иммуноглобулинов, быстро элиминируются.

Обычные антисыворотки содержат антитела, продуцируемые клетками сотен и даже тысяч клонов. При этом многие антитела направлены против антигенов, случайно присутствующих в иммунизирующем материале, и нежелательны для экспериментатора. Препараты многих высокоактивных биол. веществ, напр, гормонов, трудно очистить от балластных белков, содержание к-рых в этих препаратах в тысячи раз выше, чем содержание гормонов. Все это ограничивает возможности обычной серологии. Гибридомная технология решила эти трудности — с ее помощью могут быть получены любые количества практически гомогенных моноклональных антител, даже если иммунизирующий материал не очищен.

В конце 70-х гг. 20 в. получены первые Г. человека, выделена мутантная линия миеломных клеток, лишенных гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы. Однако получить нормальные антителосекретирующие клетки человека трудно. Если антиген безвреден, иммунизируют больных, к-рым показана спленэктомия. Используют также клетки регионарных по отношению к опухоли лимф, узлов, полагая, что среди них могут найтись клетки, иммунные против опухолевого антигена. И все же основной тип Г. мышь — мышь или крыса — мышь (первыми указаны животные-доноры нормальных клеток).

Эффективность гибридизации выше, если используют пролиферирующие антителосекретирующие клетки. Поэтому проводят не очень интенсивную иммунизацию: клетки селезенки получают через 4 дня после первого или второго введения антигена, когда процентное содержание среди них активно делящихся иммунобластов (бластов) высоко.

Наиболее трудна процедура отбора клонов, секретирующих заданные антитела. Клетки сразу после слияния весьма ранимы и плохо растут вне организма. Требуется достаточная плотность клеток в культуре, что достигается с помощью различных питательных подслоев клеток типа тимоцитов, макрофагов, к-рые в культуре не размножаются (так наз. фидеров). Даже в этих условиях необходимо вырастить определенную массу гибридных клеток, к-рая, однако, не должна быть слишком велика, т. к. обычно несекретирующие клетки растут быстрее секретирующих и вытесняют последние. Поэтому получение любой Г. нуждается в быстром тестировании продуцирующих антитела клонов и в повторном клонировании с отбором нужных клонов. Следует учитывать, что гиб-ридомные клетки нестабильны и около половины отобранных клонов гибнет, что требует постоянного реклонирования уже полученных Г.

Стабильные линии Г. ведут либо в культуре клеток, либо путем пассажей на мышах. Клетки таких линий продуцируют огромные количества антител: культуральная жидкость содержит до 50 мг моноклональных (чистейших) антител в 1000 мл; в сыворотке крови мышей, у к-рых растут Г., содержание антител составляет 300—1500 мг/100 мл. Г. часто растут в виде асцитной опухоли, если за неделю до пассажа ввести реципиенту внутрибрюшинно пристан или полный адъювант. От каждой мыши можно получить до 10 мл асцитной жидкости, содержание антител в к-рой такое же, как и в сыворотке крови. Т. о., гибридомная технология позволяет получать практически неограниченные количества высокогомогенных антител, не нуждающихся в очистке.

Продуцируемые Г. моноклональные антитела применяют во многих областях биологии и медицины. Так, их используют для изучения тонкой структуры белков, радиоиммунол, определения гормонов, тестирования тканей на гистосовместимость, определения антигенов на поверхности различных клеток, для определения локализации и для классификации опухолей и гемобластозов, для иммунотерапии злокачественных заболеваний (иногда соединенные с токсинами), для хроматографической очистки молекул соответствующих антигенов и т. д.

С помощью гибридомной технологии можно сделать бессмертной практически любую клетку, секретирующую заданный белок. Уже сейчас получены Гибридомы, к-рые секретируют регулирующие кроветворение гормоны («колонии-стимулирующий фактор»), многие белки печени и т. д. Ведутся работы по получению Гибридом, продуцирующих факторы свертывания крови, инсулин, интерферон и др.

Библиогр.: Brodsky F. M. а. о. Monoclonal antibodies for analysis of the HLA system, Immun. Rev., v. 47, p. 3, 1-979; Fazekas S., Groth St. a. Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies, J. Immunol. Methods, v. 35, p. 1, 1980; Go ding J. W. Antibody production by hybridomas, ibid., v. 39, p. 285, 1980; Kohler G. a. Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature (Lond.), v. 256, p. 495, 1975; Lymphocyte hybridomas, ed. by F. Melchers а. о., В. a. o., 1978; Rasсhke W. С. Plasmacytomas, lymphomas and hybridomas, Biochem, biophys. Acta(Amst.), v. 605, p. 113, 1980; Truccо М. М. а. о. Murine monoclonal antibodies against HLA structures, Immunol. Rev., v. 47, p. 219, 1979; Ziegler A. Monoclonal antibodies as tools in hematology, Blut, v. 41, p. 1, 1980.

И. Чертков.