МИКРОСПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
МИКРОСПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ — спектральный анализ микрообъектов, размеры к-рых не превышают 0,2—200 мкм (отдельные клетки растений или животных, внутриклеточные органоиды, одиночные микроорганизмы, скопления клеток, а также кристаллические или аморфные микрочастицы в виде порошков или различных включений). Микроспектральный анализ используется для получения информации о молекулярном или элементном составе микрообъектов. Существует несколько видов Микроспектральногой анализа.
Абсорбционный микроспектральный анализ основан на наличии у молекул любого вещества характерных полос поглощения в ультрафиолетовой или видимой области спектра — так наз. спектров поглощения (см. Спектральный анализ). Наиболее часто используется для выявления в клетках или их органоидах нуклеиновых к-т, белков, пиридиннуклеотидов, флавопротеинов, каротиноидов, цитохромов, гемоглобина и миоглобина в разных формах, хлорофиллов и других веществ, имеющих характерные спектры поглощения.
Регистрация спектров поглощения осуществляется с помощью микроспектрофотометров.
В СССР выпускаются микроспектрофотометры МУФ-5, МЛИ-2 и др. Разработан более универсальный микроспектрофотометр МАРШ, позволяющий осуществлять спектрофотометрические (см. Спектрофотометрия) и спектрополяриметрические (см. Поляриметрия) исследования микрообъекта, включая и регистрацию первой производной спектра.
Микроспектрофотометр содержит в своем составе микроскоп (обычно на ультрафиолетовую и видимую область спектра), монохроматор и систему двух лучевой регистрации с возможностью записи на самописце.
Рис. 1. Спектры люминесценции двух одиночных липофусциновых гранул (1, 2) в пирамидных нейронах коры головного мозга коровы (диаметр фотометрируемого участка — 2 мкм): максимумы на кривых указывают на присутствие в гранулах каротиноидов (1) и гемопротеинов (2); по оси ординат — оптическая плотность в относительных единицах (отн. ед.), по оси абсцисс — длина волны в нанометрах (нм), «0» — нулевая линия.
В качестве примера данных, получаемых с помощью абсорбционного М. а., на рис. 1 приведены спектры ослабления (т. е. совокупность спектров поглощения всех веществ, присутствующих в данном участке клетки, и спектров их селективного светорассеяния) крупных (размером ок. 2—2,5 мкм) липофусциновых гранул (пирамидные нейроны коры головного мозга коров), указывающие на присутствие в составе липофусциновых гранул каротиноидов (максимумы поглощения 450—480 нм на кривой 1) и гемопротеинов (максимум поглощения 420—430 нм на кривой 2).
Упрощенные системы абсорбционного микроспектрального анализа — это многоканальные микрофотометры, измеряющие оптическую плотность участка клетки одновременно в двух и более узких спектральных интервалах. Используются в качестве основы приборов для автоматического анализа клеточных популяций (обычно клеток крови) на предварительно окрашенных препаратах. Примером подобного типа классификаторов клеток могут служить приборы «Hematrac», «Coulter dif-3» и «ADC-500», предназначенные для автоматического (или полуавтоматического) анализа лейкоцитарной формулы крови.
Люминесцентный микроспектральный анализ основан на регистрации и анализе характерных спектров люминесценции в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, свойственных целому ряду химических соединений (см. Люминесценция). В качестве примеров внутриклеточных соединений, обладающих собственной люминесценцией, могут быть названы белки, восстановленные пиридин-нуклеотиды, окисленные флавопротеины, порфирины, хлорофиллы, витамины А, В и др., спектры люминесценции к-рых имеют характерное расположение максимумов излучения, позволяющее идентифицировать эти соединения в соответствующих участках живой клетки или в ее органоидах. Специфической люминесценцией, в частности, обладают митохондрии, хлоропласты, липофусциновые гранулы и т. д.
Помимо собственной люминесценции внутриклеточных соединений, часто используется предварительная обработка клеток веществами, вызывающими люминесценцию связывающих их внутриклеточных компонентов. Простейшими примерами таких соединений являются флюорохромы акридиновый оранжевый, флюоресцеин и его производные, этидиум бромид, аурамин (см. Флюорохромы).
Рис.2. Общий вид микроспектрофлюориметра: в центре расположен люминесцентный микроскоп, соединенный со спектральной фотометрической насадкой, на выходе которой установлен фотоумножитель (справа на рисунке), от которого сигнал передается на самописец (слева на рисунке).
Прибор для люминесцентного М. а. представляет собой комбинацию люминесцентного микроскопа (см.), спектроанализирующей системы и регистрирующего устройства. На практике используются разнообразные микроспектрофлюориметры. Примером может служить разработанный в Ин-те биологической физики АН СССР микроспектрофлюориметр, в к-ром используются стандартные узлы, выпускаемые промышленностью СССР (рис. 2). Основу прибора составляет люминесцентный микроскоп, соединенный со спектральной фотометрической насадкой, на выходе к-рой установлен фотоумножитель (см.). Выходной сигнал фотоумножителя поступает на самописец. Возбуждение люминесценции осуществляется сверхстабильной ртутной дуговой лампой, питаемой источником стабилизированного напряжения.
Рис. 3. Люминесцентная микроскопия липофусциновых гранул в нейронах гиппокампа человека: а — липофусциновые гранулы в поле зрения микроспектро флюориметра: темное пятно в центре — тень фотометрического зонда в плоскости препарата; б — спектры люминесценции липофусциновых гранул (1, 2, 3), записанные в различных участках препарата с помощью фотометрического зонда; по оси абсцисс — длина волны в нанометрах (нм), по оси ординат — оптическая плотность в относительных единицах (отн. ед.).
Важной особенностью люминесцентной микроспектрофлюориметрии является возможность использования «зондовой» системы наблюдения, представляющей собой зеркало с отверстием — фотометрическим зондом — в центре. Это зеркало установлено в ходе лучей люминесцентного микроскопа в плоскости изображения, и потому, совместив зонд с интересующим участком люминесцентного изображения препарата, можно одновременно наблюдать и люминесцентное изображение и фотометрический зонд (рис. 3).
Т. о., имеется возможность одновременного морфол, и спектрального анализа клетки (или ее частей).
Другой особенностью микроспектрофлюориметра является использование возбуждения люминесценции «падающим» на объект излучением. При этом один и тот же микрообъектив применяется и для возбуждения люминесценции, и для регистрации люминесцентного излучения микрообъекта. Появилась возможность исследовать одиночные клетки не только на мазках или тонких срезах (замороженных или парафиновых), но и непосредственно на поверхности органа — in situ.
Для идентификации внутриклеточных веществ по характерным спектрам люминесценции используют также наблюдение за изменением спектральных характеристик объекта во времени при действии на объект тех или иных хим. или физ. факторов.
Лазерный эмиссионный микроспектральный анализ основан на использовании характерных спектров оптического излучения атомов различных хим. элементов, возбуждаемых электрическим разрядом. Является разновидностью эмиссионного спектрального анализа (см.) и предназначен для качественного и количественного определения элементного состава микрообразцов диаметром в пределах 20—40 мкм. Установка для этого вида М. а. включает микроскоп, лазерный источник возбуждения, генератор искры и спектрограф. С помощью микроскопа находят нужный участок микрообъекта, импульс лазерного излучения испаряет и частично возбуждает вещество в исследуемом микроучастке препарата. Электрическая искра дополнительно возбуждает характеристическое излучение атомов различных элементов, входивших в состав испаряемого участка микрообъекта. Это излучение анализируется спектрографом, и спектр излучения фиксируется на фотопластинке. Анализ спектра позволяет установить элементный состав испаренного участка микрообъекта. Для лазерной эмиссионной микроспектроскопии применяют установку МСЛ-2 (СССР) и лазерный микроспектроанализатор LMA-10 (ГДР).
Рентгенолюминесцентный микроспектральный анализ — использует характеристические спектры рентгеновского излучения атомов, входящих в состав изучаемого микроучастка клетки или ткани, для количественного и качественного определения его элементного состава. Является разновидностью рентгеноспектрального анализа. Возбуждение рентгеновского излучения атомов производится узким пучком ускоренных электронов. Установка для рентгенолюминесцентного анализа состоит из электронного микроскопа, соединенного со спектрометром рентгеновского излучения. Размеры анализируемого участка на практике составляют 1 мкм и более. Метод применяется в биологии и медицине для выявления распределения элементов в различных внутриклеточных органоидах, клетках и тканях.
Микроспектральный анализ в судебно-медицинском отношении. В суд.-мед. практике М. а. применяется для установления наличия крови путем перевода гемоглобина в его производные. В суд.-мед. лабораториях чаще используется метод микроспектрального абсорбционного анализа (см. выше), М. а. особенно эффективен при малых количествах исследуемого материала.
При проведении исследования соскоб с анализируемого объекта помещают на предметное стекло, обрабатывают 1 — 2 каплями 33% р-ра щелочи, а затем восстановителя и накрывают покровным стеклом. При этом происходит образование гемохромогена (см.). Предложены и другие методы образования гемохромогена, в т. ч. фенольная реакция. Для этого на предметное стекло помещают частицы исследуемого вещества и фенола в соотношении 1 : 10, прибавляют какую-либо соль железа (или металлическое железо), нагревают на пламени горелки, затем добавляют 50% р-р гидразингидрата в глицерине. Фенольную реакцию чаще всего применяют при исследовании «старых» пятен. В приготовленном препарате под микроскопом выбирают подходящий по цвету участок. Затем на место окуляра вставляют насадку (микроспектроскоп). Наличие спектра гемохромогена служит основанием для вывода о присутствии в пятне крови. При отрицательном результате рекомендуется увеличить время наблюдения, выбрать для исследования другие участки препарата или приготовить его вновь. Микроспектральное исследование препарата производят также путем перевода кровяного остатка в гематопорфирин (см. Гематопорфириновая проба).
Для изготовления такого препарата частицу исследуемого вещества (соскоб, волокно ткани) помещают на предметное стекло, добавляют 2—3 капли конц. серной к-ты и подвергают микроскопии, отыскивая участок, окрашенный в красно-фиолетовый, сиреневый или серо-зеленый цвет. Затем выбранный участок подвергают микроспектральному анализу. По характерному расположению h особенностям полос поглощения устанавливают наличие спектра гематопорфирина в кислом р-ре; при отрицательном результате исследование повторяют. Отрицательные повторные исследования свидетельствуют о том, что кровь в пятне отсутствует (за исключением тех случаев, когда кровь в пятне подверглась воздействию высокой температуры — до степени обугливания). В сомнительных случаях рекомендуют исследование в УФ-лучах с использованием специального люминесцентного микроскопа или люминесцентных осветителей, что позволяет выявить на препарате участки, содержащие гематопорфирин по их пурпурно-красному свечению; в этих участках с помощью М. а. исследуется наличие гематопорфирина. Для выявления весьма малых количеств крови предложен микроспектрографический метод исследования, позволяющий устанавливать наличие абсорбционных свойств гемохромогена при исследовании частиц диам. ок. 5—10 мкм, а спектр гематопорфирина — при частицах диам, до 50 мкм.
Библиография:
Агроскин Л. С. и Папаян Г. В. Цитофотометрия, Л., 1977;
Баренбойм Г. М., Доманский А. Н. и Туроверов К. К. Люминесценция биополимеров и клеток, М.— Л., 1966; Бронникова М. А. и Гаркави А. С. Методика и техника судебномедицинской экспертизы вещественных доказательств, М., 1963; Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки, М., 1978; Туманов А. К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств, М., 1975; Microprobe analysis as applied to cell and tissues, ed. by T. Hall a. o., L,— N. Y., 1974.
В. П. Карнаухов; В. М. Смольянинов (суд. мед.).