НУКЛЕАЗЫ

НУКЛЕАЗЫ — группа ферментов, специфически атакующих (способ воздействия) нуклеиновые кислоты и катализирующих расщепление межнуклеотидных связей в поли- или олигонуклеотидах без образования неорганического фосфата; по характеру каталитического действия являются фосфодиэстеразами. Н. обнаружены во всех живых организмах. Им принадлежит существенная роль в клеточном метаболизме и в обмене веществ организма в целом; они участвуют в пищеварении, разнообразных процессах обмена нуклеиновых кислот (см.), генетической рекомбинации, исправлении генетических повреждений (репарации) и защите клетки от чужеродных нуклеиновых к-т. Величина активности Н. в различных тканях и биол, жидкостях человека имеет значение для диагностики ряда заболеваний. Так, увеличение во много раз активности дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы I) в сыворотке крови наблюдают при острых воспалительных процессах в поджелудочной железе, в частности при остром панкреатите и особенно его геморрагической форме. Повышение активности рибонуклеазы (РНК-азы) в сыворотке крови отмечают при уремии. Нарушение активности Н., участвующих в процессах репарации, предположительно, играет основную роль в патогенезе различных форм тяжелого наследственного заболевания — пигментной ксеродермы.

Н. находят широкое применение в клин, практике. ДНК-азу, напр., используют для лечения нек-рых тяжелых вирусных инфекций, вызываемых гл. обр. аденовирусами и вирусами герпеса, нек-рых заболеваний нервной системы, нагноительных процессов, менингита (см. Дезоксирибонуклеазы). Препараты РНК-азы оказались эффективными при лечении клещевого энцефалита (см. Рибонуклеазы).

Специфические Н. часто применяются в биохим, и молекулярно-биол. исследованиях структуры и функций нуклеиновых к-т и всего генетического аппарата клетки.

Н. найдены во многих тканях и жидкостях тела человека: печени, селезенке, тимусе, слюне, сыворотке крови. Высокой активностью Н. отличаются растущие молодые ткани.

Хотя все Н. по характеру своего действия являются фосфодиэстеразами, однако механизм разрыва фос-фодиэфирной связи может быть различным. Поэтому группа Н. включает в себя представителей нескольких классов и подклассов ферментов (см.). Прежде всего это гидролазы фосфодиэфиров (КФ 3.1.4) — ферменты, катализирующие разрыв межнуклеотидных связей путем прямого гидролиза. Сюда относятся все ДНК-азы, деполимеризующие молекулы ДНК, нуклеазы, не проявляющие заметной специфичности к углеводному компоненту нуклеиновой к-ты и атакующие как ДНК. так и РНК, а также нек-рые РНК-азы, катализирующие деполимеризацию молекул РНК. Другая (большая) часть РНК-аз осуществляет расщепление молекул РНК не путем прямого гидролиза, а через предшествующее ему внутримолекулярное перефосфори-лирование.

По способу атаки субстрата Н. разделяют на две категории: эндонуклеолитические (эндонуклеазы) и экзонуклеолитические (экзонуклеа-зы); эти термины предложены в 1959 г. Лясковским (М. Laskowski). Эндонуклеазы расщепляют полинуклеотид между внутренними звеньями полимерной цепи. При этом часто проявляется определенная степень избирательности фермента — специфичность к хим. природе оснований, находящихся по соседству с атакуемыми связями. Примерами строго специфичных эндонуклеаз могут служить пиримидинспецифичная РНК-аза I (КФ 3.1.4.22) животных тканей и гуанинспецифичная РНК-аза TI из Aspergillus oryzae (гуанилрибонуклеаза; КФ 3.1.4.8). ДНК-азы,как правило, не обладают строгой специфичностью в отношении азотистых оснований, окружающих атакуемую связь в молекуле ДНК, наблюдаются лишь различия в скоростях гидролиза в зависимости от типа основания. По механизму эндонуклеолитического расщепления ДНК эндонуклеазы разделяют на ферменты, производящие разрыв двух комплементарных цепей в одном и том же месте (двуударный механизм) и случайным образом в разных участках каждой из цепей, так что разрывы во всей двуспиральной молекуле образуются не сразу, а только при условии симметрично расположенных разрывов в комплементарных цепях (одноударный механизм) .

Экзонуклеазы катализируют последовательное отщепление мононуклеотидов от одного из концов полинуклеотидной цепи. В результате происходит деполимеризация молекулы нуклеиновой к-ты вплоть до олиго- или мононуклеотидов. Большинство экзонуклеаз не обладает сильно выраженной специфичностью по отношению к азотистым основаниям нуклеотидов, соседних с атакуемыми связями. Нек-рые экзонуклеазы способны гидролизовать оба типа нуклеиновых к-т, хотя сродство к ДНК и РНК у них обычно неодинаковое. Направление перемещения экзонуклеазы вдоль цепи полинуклеотида (3’—>5′ или 5’—>3′) различно для разных ферментов.

Разделение Н. на эндо- и экзонуклеазы в достаточной степени условно. Детальные исследования высо-коочищенных препаратов Н. указывают на то, что в действительности индивидуальный фермент может обладать способностью катализировать как эндо-, так и экзонуклеолитиче-ское расщепление в зависимости от структуры макромолекулярного субстрата (таким действием обладает, напр., нуклеаза микрококков, КФ 3.1.4.7, выделенная из патогенных штаммов Staphylococcus aureus).

Кроме того, возможны изменения в характере ферментативной атаки (эндо- или экзо-) и в специфичности к азотистым основаниям, граничащим с атакуемой связью, на ранних и конечных стадиях реакции.

Существенным критерием для классификации Н. служит положение атома углерода в остатке рибозы или дезоксирибозы нуклеотида (3′-или 5′-), у к-рого происходит расщепление фосфодиэфирной связи. В зависимости от этого образуются продукты гидролиза с концевым 5′-или З’-монофосфатом соответственно. Н. характеризуются также различной чувствительностью ко вторичной структуре субстрата.

В особую категорию Н. следует выделить так наз. ферменты рестрикции, или рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), обнаруженные пока только у микроорганизмов, но существование к-рых имеет, вероятно, принципиальное общебиологическое значение. Пока их описано ок. 150; к 1978 г. более 50 рестрикционных эндонуклеаз признано индивидуальными ферментами. Эти ферменты, обладая исключительной специфичностью, «узнают» нуклеотидные последовательности строго определенного состава и «нарезают» молекулы двуспиральной ДНК на крупные фрагменты. В результате из данной ДНК всегда образуется присущий данной рестриктазе набор фрагментов, характерных по размеру и структуре. Многие рестриктазы расщепляют цепи двуспиральной ДНК в несовпадающих точках — со сдвигом в несколько нуклеотидов.

Большинство Н. представляет собой небольшие глобулярные белки с выраженными основными свойствами [исключение составляют крупные АТФ-зависимые ДНК-азы, их мол. вес (масса) достигает 350 000].

ДНК-азы и неспецифические эндонуклеазы обычно термолабильны, имеют оптихмум pH в нейтральной или щелочной области, активируются двухвалентными катионами и ингибируются комплексобразующими (хе-латирующими) агентами. РНК-азы в большинстве случаев активны при кислых и щелочных значениях pH; активируются одно- и двухвалентными катионами. Нек-рые РНК-азы не требуют активаторов и отличаются высокой термостабильностью (напр., РНК-аза из поджелудочной железы человека максимальную активность проявляет при 65° и выдерживает без заметного изменения активности кратковременное нагревание до 100°).

Локализация Н. связана с физиол. функциями этих ферментов. Н. микроорганизмов, расположенные около клеточной стенки и секретируемые в окружающую среду, участвуют в питании бактерий, расщеплял субстраты, не проникающие внутрь клетки. Внеклеточные ДНК-азы патогенных бактерий, возможно, играют роль в патогенезе нек-рых инфекций. Для патогенных микроорганизмов, выделяющих экзотоксины, установлена корреляция между токсинообразованием и секрецией ДНК-азы. Такие эндонуклеазы животных, как РНК-аза I и ДНК-аза I из поджелудочной железы, образующиеся в зимогенных гранулах железы и секретируемые в поджелудочный сок, обеспечивают расщепление нуклеиновых к-т при пищеварении и усвоении их компонентов клеткой. Эти ферменты участвуют также в разрушении тканей и микроорганизмов при различных патол, процессах. Внутриклеточные Н. могут являться частью ферментных систем, защищающих клетку от инфекции чужеродными ДНК, напр. ДНК вирусов. В ядрах, цитозоле, митохондриях и лизосомах локализованы Н., выполняющие регуляторные функции или непосредственно участвующие в процессах синтеза и распада, созревания (процессинга), репарации и рекомбинации генетического материала. Кислые Н., содержащиеся в лизосомах, действуют после выхода из них через лизосомную мембрану при нек-рых физиол, состояниях клетки и при ее разрушении.

Нек-рые ДНК-полимеразы обладают экзонуклеазной активностью, благодаря к-рой при их участии удаляется затравочный конец ДНК неспаренных или неправильно спаренных нуклеотидов, что обеспечивает правильность копирования ДНК-матрицы в процессе репликации.

В 1966 г. Карриер (W. L. Carrier) и Сетлоу (R. В. Setlow) показали, что повреждения в молекуле ДНК, вознршающие при облучении бактерий УФ-лучами и выражающиеся в образовании димера тимина, могут быть исправлены самими клетками путем «вырезания» димеров из молекулы ДНК. Каталитический механизм этого процесса обеспечивается Н. Известны три системы, исправляющие или компенсирующие повреждения ДНК, вызываемые ионизирующими излучениями, хим. агентами и т. д. Это Темновая репарация, репарация в результате обмена фрагментами ДНК при рекомбинации, фотореактивация — расщепление димеров тимина ферментами, активируемыми светом с длиной волны ок. 400 нм (см. Репарация генетических повреждений).

На первых стадиях темповой репарации специфическая эндонуклеаза «рассекает» дефектную цепь дву-сииральной ДНК рядом с местом повреждения. Образующийся в цепи единичный разрыв использует экзонуклеаза, «вырезая» область, содержащую поврежденный участок. После «вырезания» или одновременно с этим процессом происходит репаративные синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, к-рая использует в качестве матрицы неповрежденную цепь, и, наконец, сшивание ферментом лигазой концов старой и вновь синтезированной цепей.

Схема соединения азотистых оснований в полинуклеотидную цепочку нуклеиновой кислоты; R — H для ДНК и OH для РНК.

Часть повреждений цепи ДНК, вызываемых алкилирующими агентами или ионизирующими излучениями, не может быть восстановлена по механизму темновой репарации и исправляется в результате обмена поврежденного участка ДНК на неповрежденный в процессе рекомбинации генов (см. Рекомбинация). Все большее значение приобретают представления о рекомбинации как о процессе, связанном с «узнаванием» определенных участков ДНК специфическими Н.

Большинство методов определения активности Н. основано на осаждении не деградированной ДНК или РНК из реакционной смеси с последующим определением количества кислоторастворимых продуктов реакции — олиго- и мононуклеотидов или на измерении гиперхром-ного эффекта (нарастания оптического поглощения) при 260 нм, обусловленного деполимеризацией нуклеиновой к-ты. В клин, практике активность ДНК-азы часто определяют по изменению вязкости (см.) р-ров полимерной ДНК в процессе ее ферментативной деградации. Поскольку первая стадия расщепления рибонуклеиновых к-т РНК-азой (образование циклофосфатов) идет с гораздо большей скоростью, чем вторая стадия (собственно гидролиз), определение РНК-азой активности в нек-рых случаях проводят, измеряя гипохромизм (уменьшение оптического поглощения) при 300 нм р-ра РНК, обусловленный образованием циклических фосфатов.

Библиография: Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот, пер. с англ., с. 193, М., 1976; Нуклеазы микроорганизмов, под ред. А. М. Безбородова, М., 1974; Ш а п о т В. С. Нуклеазы, М., 1968, библиогр.; The enzymes, ed. by P. D. Boyer, v. 4, p. 153, N. Y.— L., 1972.

П.Л. Иванов.