МУТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ

Мутационный анализ (лат. mutatio изменение, перемена) — изучение мутаций с целью исследования строения, функции и организации генетического материала организмов, в т. ч. и человека. Основой М. а. служат методы выявления и учета мутаций. Методы выяснения частоты мутирования как суммарно в популяции, так и по отдельным линиям и даже по отдельным генам, позволяющие количественно оценить темпы мутирования, вначале были разработаны в эксперименте для дрозофилы, а затем и для других организмов, в т. ч. и для человека.

Мутации (см.) у дрозофилы, как и у всех других организмов, способны влиять на любой признак — морфологический, биохимический, физиологический, поведенческий и т. д. Учесть весь спектр мутаций практически невозможно; количественный анализ возможен только для тех мутаций, к-рые могут быть зарегистрированы сравнительно легко и объективно. К таким мутациям относится ряд мутаций в определенных локусах, а также мутации, приводящие к гибели особи — так наз. летальные мутации. Одна из методик, позволяющих регистрировать возникновение летальных мутаций в Х-хромосоме у дрозофилы, получила наименование методики CLB. Символ С означает, что эта хромосома не показывает кроссинговера (см. Рекомбинация, хромосом), символ L указывает на присутствие летальной мутации, а символ В — на присутствие доминантной мутации Ваг, контролирующей признак «узкие глаза», используемый исследователями в качестве доказательства присутствия изучаемой хромосомы. Присутствие хромосом CLB приводит к гибели самцов, т. к. у них в гемизиготном состоянии действует летальный ген (L).

Другая методика, позволяющая количественно оценивать мутации, называется Меллер-5. Гомозиготные по Х-хромосоме самки дрозофил — yscs А49 (символы обозначают наличие следующих мутаций: у — желтый цвет тела; sc8 — редукция щетинок; А 49 — отсутствие кроссинговера) в скрещивании с нормальным самцом дают в случае появления летальной мутации в поколении F2 только желтых самцов, а в случае отсутствия мутации половина самцов будет серыми, а половина — желтыми.

Летальные мутации в аутосомах дрозофилы можно учитывать с помощью линий, сбалансированных по леталям (генам, вызывающим гибель особи до наступления зрелости; гены, вызывающие гибель только гомозигот, называют рецессивными деталями; гены, вызывающие гибель гетерозигот,— доминантными деталями); при разведении выживают только те потомки мушек этих линий, к-рые имеют определенный генотип (см.). Для наблюдения за этими потомками в качестве маркеров используют различные доминантные мутации, напр, гены Cy (загнутые крылья), L (уменьшенные глаза), Pm (коричневые глаза).

Для поисков видимых мутаций у дрозофил можно также использовать линию со сцепленными Х-хромосомами. Метод учета мутаций в аутосомах дрозофилы позволяет аккумулировать мутации, возникающие в течение ряда поколений, что существенно для анализа небольших различий в темпе мутаций. Используя этот метод, Меллер (Н. J. Muller) получил статистически достоверные данные о ранее неуловимых изменениях в темпе мутирования. Он показал, что при увеличении температуры инкубации дрозофил на 10° темп мутирования возрастает в 2—3 раза. Методы учета мутаций у дрозофилы широко применяют в опытах по получению множества разных мутаций и аллелей генов, а также в опытах, целью к-рых является доказательство мутагенных эффектов проникающей радиации и хим. мутагенов (см.). Метод сбалансирования леталей был использован для глубокого анализа проблем генетики природных популяций.

Породные и индивидуальные различия животных, сортовые и внутривидовые различия растений появились в результате возникновения мутаций в генетическом материале. Такие мутации могут возникать в разных генах и в разных аллелях одного гена. Особь, несущую мутации в обоих аллелях, называют компаундом. Описаны сотни мутаций кукурузы, гороха, пшеницы, томатов и других растений, крупного рогатого скота, овец, кур и многих других животных. Для нек-рых из них разработаны методы точного учета возникающих мутаций. Для анализа мутаций у ячменя часто используют мутации, вызывающие блокирование синтеза хлорофилла, в результате к-рых появляются белые проростки. Такие мутанты легко обнаружить на любом ячменном поле. М. а. показал, что синтез хлорофилла представляет собой сложный процесс, контролируемый многими генами. Мутации альбинизма рецессивны, и их учет проводят по расщеплению в поколении F2. При самоопылении гетерозиготное растение (Аа) дает в поколении F2 потомство, среди к-рого в 25% случаев появляются альбиносы. У так наз. перекрестников анализ мутаций более сложен (см. Менделя законы). Для учета мутаций у высших организмов используют способ разведения родственных, или так наз. инбредных, линий, к-рый позволяет выявить мутации, возникшие у предков. Скрещивание родственных особей, получивших от предков одну и ту же размноженную мутацию, ведет к выщеплению рецессивных мутаций. Таким способом у кукурузы обнаружено более 500 мутаций; несколько сот мутантных генов выявлено у томатов. С помощью инбридинга (см.) обнаружено много мутантных генов у японского перепела, кур и др.

Анализ частоты мутирования проводят на мышах определенных генетических линий при помощи теста доминантных леталей: производят вскрытие беременных самок мышей и определяют количество погибших эмбрионов, что позволяет судить о частоте появления доминантных мутаций, прерывающих развитие зиготы. Изучение частоты мутаций у мышей, причиной к-рых служила радиация, дало возможность рассчитать генетическую опасность повышенного фона радиации в окружающей среде с точки зрения ее влияния на наследственность млекопитающих.

Изучение мутаций у нейроспоры (Neurospora) в первую очередь связано с учетом биохимических мутаций. Дикая форма этой плесени является прототрофом (см. Ауксотрофные микроорганизмы). Чтобы не потерять возникающие ауксотрофные мутации, поскольку неизвестно, какое звено метаболизма блокировано, нейроспоры вначале помещают на полную органическую среду. Затем потомство этих нейроспор индивидуально проверяют. Неспособность размножаться на минимальной среде указывает на наличие биохим, мутации. Добавляя в среду различные метаболиты, можно определить тот уровень обмена веществ плесени, на к-ром произошла мутация.

Первые работы по изучению мутаций у бактерий выполнили Лурия (S. E. Luria) и М. Дельбрюк в 1943 г., Демерек (М. Demerec) и др. в 1945 г.

Поскольку всегда остается неизвестным, какую мутацию вызвал тот или иной фактор, для учета мутаций у бактерий (см. Бактерии, генетика бактерий) нек-рое количество клеток из каждой колонии высевалось на полной твердой питательной среде и сразу после воздействия мутагена какое-то количество клеток переносилось на среды, в состав к-рых не входили различные метаболиты. Однако этот метод очень трудоемок, кроме того, с его помощью трудно выявить мутации, возникающие с частотой 1 мутация на 10 млн. бактериальных клеток.

В 1952 г. Ледерберг (J. Lederberg) и Ледерберг (Е. Lederberg) предложили так наз. метод реплик (отпечатков). Сущность его состоит в том, что с помощью стерильного кружка из бархата все выросшие на полной питательной среде бактериальные колонии одновременно переносят на серию селективных сред. Сопоставляя рост бактерий на полной и селективных средах, можно определить, какое звено метаболизма блокировано мутацией.

Мутационный анализ сыграл значительную роль в конкретизации представления о генотипе как о системе взаимодействующих генов. Особенно интересна в этом отношении разработка теста на комплементарность. В 1951 г. Льюис (Е. Lewis) разработал функциональный тест: две мутантные клетки, не способные, напр., синтезировать одну и ту же аминокислоту, могут дать потомство дикого или близкого к дикому фенотипа. Возможность такого явления определяется тем, что сходные фенотипические проявления могут быть следствием мутационных нарушений различных звеньев одной цепи метаболизма. Сочетание в одной клетке двух дефектных геномов может обеспечить синтез полного набора ферментов и привести к восстановлению утраченной функции. Мутации, блокирующие различные звенья метаболизма, никогда не перекрывают друг друга. Если гетерокарион (см. Кариотип) сохраняет мутантный фенотип, это означает, что мутации располагаются друг против друга, затрагивают одну и ту же функцию, и, следовательно, комплементация невозможна. Т. о., тест на комплементарность позволяет определить, затрагивает ли мутация одну и ту же или различные функц, группы.

Явление межаллельной комплементации присуще в основном генам, контролирующим синтез ферментов, функциональная активность к-рых определяется четвертичной структурой. Объединение в молекулу субъединиц, несущих различные мутационные изменения, приводит к исправлению дефекта фермента.

Учет мутаций у бактериофагов производят по появлению так наз. стерильных пятен, т. е. локальных пятен лизированных клеток на газоне бактериальной культуры. Таким способом выявляют мутации бактериофагов, изменяющих морфологию стерильных пятен, устойчивость к ядам и т. д. Среди всех мутаций бактериофагов практически наиболее значим класс летальных мутаций.

Однако изучить их обычными методами нельзя, ибо отдельная частица фага с летальной мутацией погибает, ускользая от наблюдателя. Появление летальных мутаций у бактериофагов оказалось возможным изучать на так наз. условно-летальных мутациях, обычно не проявляющих своего действия, однако при изменении условий они убивают частицы фага. Так, дикий тип фага Т4 развивается в широком диапазоне температур — от 25 до 42°. Температурно-зависимые мутации при 25° размножаются нормально, а при 42° погибают, не образуя стерильных пятен.

Нек-рые мутации, напр, амбер-мутации, изменяют бактериофаг таким образом, что делают его способным размножаться на бактериях лишь определенной линии.

К концу 70-х гг. 20 в. у человека было обнаружено 2336 мутаций. Особое значение для слежения за частотой мутаций у человека приобрел анализ появления мутаций по белкам крови. Мутационный анализ позволил изучить структуру гена гемоглобина (см.) и другие важные особенности организации генетического материала человека.

Библиография: Ауэрбах Ш. Проблемы мутации, пер. с англ., М., 1978; Дубинин Н. П. Общая генетика, М., 1976; Захаров И. А., Генетические карты высших организмов, JI., 1979.

Н. П. Дубинин.