ДИШЕ МЕТОДЫ

Дише методы (Z. Dische, австрийский химик) — I метод количественного определения ДНК, основанный на появлении интенсивного окрашивания при взаимодействии дезоксирибозы с дифениламином в присутствии уксусной и серной кислот; находит применение в биохимии нуклеиновых кислот; II— метод количественного определения фукозы (метилпентозы) в сыворотке крови, являющийся вспомогательным клинико-диагностическим тестом при ряде заболеваний.

I. Метод количественного определения ДНК

Метод предложен Дише в 1930 г. Под действием к-т от ДНК отщепляются пуриновые основания, из освобождающейся дезоксирибозы в результате дальнейших превращений образуется ω-океилевулиновый альдегид, который реагирует с дифениламином с образованием соединения, имеющего синюю окраску.

Ход определения

Одну часть исследуемого р-ра ДНК (1—2 мл) смешивают с двумя частями дифениламинового реактива (1 г дифениламина растворяют в 100 мл ледяной уксусной к-ты и добавляют 2,75 мл конц. серной к-ты), нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин. При нагревании развивается устойчивая синяя окраска, оптическую плотность к-рой определяют при 595 нм и сравнивают с оптической плотностью стандартного раствора ДНК.

Имеется ряд веществ, мешающих определению ДНК при помощи реакции Дише. С дифениламином реагирует не только 2-дезоксирибоза, но вообще 2-дезоксипентозы; при взаимодействии дифениламина с рибозой в присутствии сильных к-т развивается зеленое окрашивание, однако чувствительность этой реакции в 10 раз ниже чувствительности реакции с дезоксирибозой, поэтому определению ДНК мешают только значительные примеси РНК. Зеленую окраску дают и некоторые альдегиды (бензальдегид, салицилальдегид). Для повышения специфичности метода рекомендуется определять оптическую плотность при двух различных длинах волн: разность между поглощением при 595 и 650 нм можно использовать для определения малых количеств ДНК в присутствии любых примесей, дающих зеленое окрашивание.

При помощи Дише метода можно определить от 50 до 500 мкг ДНК.

См. также Дезоксирибонуклеиновые кислоты.

II. Метод количественного определения фукозы (метилпентозы)

Предложен Дише в соавторстве с Шеттлсом (L. В. Shettles) в 1948 г., основан на специфической цветной реакции, к-рую дают метилпентозы с сульфгидрильными (SH-содержащими) соединениями при нагревании с серной к-той.

Фукоза входит в состав гликоновой части гликопротеидов сыворотки крови, поэтому перед определением ее необходимо отщепить от молекулы гликопротеида при помощи кислотного гидролиза.

Ход определения

При определении содержания фукозы в гликопротеидах сыворотки крови к 0,1 мл сыворотки добавляют 5,0 мл 95% этанола, центрифугируют, дважды декантируют (см. Декантация), осадок растворяют в 1,0 мл 0,1 н. NaOH. К 1,0 мл исследуемого р-ра добавляют 4,5 мл охлажденной во льду смеси серной к-ты и воды (6 : 1), хорошо перемешивают, нагревают до 20—22° в течение нескольких минут и затем помещают в кипящую водяную баню на 3 или 10 мин., после чего охлаждают проточной водой. К охлажденному р-ру прибавляют 0,1 мл 3% водного цистеина гидрохлорида и встряхивают; через 1,5—2 часа при комнатной температуре появляется зелено-желтое окрашивание, к-рое практически не изменяется в течение 24 час. Чтобы внести поправку на неспецифическое появление окраски, проводят две контрольные пробы: первая содержит вместо исследуемого р-ра 1,0 мл воды; вторая аналогична опытной пробе, но не содержит цистеинового реактива. Оптическую плотность раствора определяют при 396 нм (максимум поглощения) и 430 нм (отсутствие поглощения) для исключения влияния гексоз и пентоз. Цистеиновая реакция при 10-минутной инкубации обнаруживает большую специфичность в отношении фукозы (пентозы, гексозы и гексуроновые к-ты в этом случае дают розовое окрашивание), чем та же реакция при 3-минутной инкубации, однако последняя дает возможность одновременно определять и гексозы (см.). Гексозы в этом случае дают желтое окрашивание, как и фукоза, но обнаруживают значительное поглощение при 430 нм (максимум поглощения для гексоз находится при 415 нм, поглощение при 430 нм равно поглощению при 396 нм). Разность между величиной оптической плотности при длине волны 396 и 430 нм является специфичной для фукозы, строго пропорциональна ее концентрации и не зависит от избытка гексоз. Количество фукозы в исследуемом р-ре рассчитывают, сравнивая величину разности оптической плотности при 396 и 430 нм со значениями, полученными для контрольных проб.

В сыворотке крови в норме содержится от 7,7 до 9,0 мг% фукозы. Увеличение содержания фукозы в гликопротеидах сыворотки крови отмечают при туберкулезе и раке легких, сердечной недостаточности II и III степени, раке печени, амилоидно-липоидном нефрозе.

См. также Фукоза.

Библиография: Асатиани В.С. Новые методы биохимической фотометрии, с. 234, 272, М., 1965; Химия и биохимия нуклеиновых кислот, под ред. И. Б. Збарского и С. С. Дебова, с. 76, Л., 1968; Disсhe Z. Nachweis und Bestimmung der Thymonukleinsaure, Handb, biol. Arbeitsmeth., hrsg. v. E. Abderhalden, Abt. 5, T. 2, Hft 16, S. 1829, B. — Wien, 1931; Disсhe Z. а. Shettles L. B. A specific color reaction of methylpentoses and a spectrophotometric micromethod for their determination, J. biol. Chem., v. 175, p. 595, 1948.

Л. М. Пименова.