КОЛОРИМЕТРИЯ

Колориметрия (лат. color цвет + греч. metreo мерить, измерять) — физико-химический метод определения интенсивности окраски раствора анализируемого вещества, основанный на визуальных или фотоэлектрических измерениях. Метод широко применяется в клинических, биохимических и химических исследованиях для определения концентраций различных веществ в растворах.

Большинство унифицированных клинических лабораторных биохимических методов исследования имеют фотоколориметрическое завершение (о-толуидиновый метод определения сахаров, глюкозооксидазный метод определения глюкозы в крови и др.). Колориметрические методы точны и мало трудоемки. Все автоматизированные клин, биохим, методы являются колориметрическими или спектрофотометрическими. Фотоколориметрия широко применяется при контроле производства лекарственных препаратов в фармацевтической промышленности, в контрольно-аналитических лабораториях, в. сан-гиг. лабораториях. К. используют также при определении величины pH р-ров двухцветными индикаторами в присутствии буферного р-ра (или без него); в фотоколориметрии применяют одноцветные индикаторы без буферного р-ра. Определение различных веществ в р-ре с помощью цветных реакций применялось очень давно; впервые делать это стали врачи. В России анализы минеральных вод колориметрическими методами стали производиться с начала 18 в. Их проводили гл. обр. врачи и аптекари, используя в качестве реактивов соки растений.

В. М. Севергин разработал ряд колориметрических методов анализа минеральных вод и расширил число элементов, определяемых методом К.

При помощи Колориметрии определяют или собственную окраску анализируемого вещества, или окраску продукта реакции. Колориметрически можно определить от 10^-3 до 10^-8 моль/л. Фотоэлемент «видит» часть УФ-спектра и применяется в «ультрафиолетовой колориметрии». Глаз человека очень чувствителен к оттенкам цветов, но воспринимает лишь небольшой участок спектра; кроме того, у людей имеются индивидуальные различия в такой чувствительности. Применение фотоэлемента устраняет эти недостатки глаза. Поглощение (абсорбция) света окрашенным р-ром в ряде случаев подчиняется закону Бугера — Ламберта — Беера, по к-рому количество поглощенного света зависит от толщины слоя (длины оптического пути) и концентрации окрашенного р-ра (т. е. концентрации поглощающего вещества). Оптическая плотность р-ра D = lg(I₀/I), где I₀ — интенсивность входящего в р-р светового потока, I — интенсивность ослабленного светопоглощением в р-ре выходящего светового потока. Если толщина слоя р-ра b, то lg(I₀/I) = k*b, где k — постоянная величина. При постоянной толщине слоя р-ра D = k₁*C, где C — концентрация, k₁ — постоянная величина, равная (k/2,303). Объединяя два уравнения, получаем

D = lg(I₀/I) = k₁*b*C.

Если b = 1 см, C = 1 моль/л, то D = k₁. Постоянную k₁ называют молярным коэффициентом экстинкции и обозначают греч, буквой ε. Молярный коэффициент экстинкции зависит от хим. состава, строения и состояния вещества и от длины волны проходящего через р-р света. Закон Бугера — Ламберта — Беера справедлив только для монохроматического света, т. е. потока света, длина волн к-рого (λ) одинакова. Величина ε для различных соединений меняется от 10¹ до 10⁵. Чем больше величина ε, тем чувствительнее метод.

Отношение интенсивности монохроматического потока излучения, прошедшего через исследуемый р-р, к интенсивности первоначального потока счета называют прозрачностью или пропусканием р-ра и обозначают буквой T. Величину T выражают обычно в процентах: T = 100*I₀/I (%).

Поглощение р-ра, обозначаемое буквой А, выражают также в процентах: А = 100(I₀-I)/I(%).

В Колориметрии надлежит пользоваться монохроматическим светом. Монохроматизация достигается применением светофильтров, представляющих собой окрашенные среды, пропускающие световой поток только с определенной длиной волны, однако часто применяют светофильтры, выделяющие узкие области спектра. Светофильтр пропускает свет, дополнительный к цвету р-ра, т. е. соответствующий той области спектра, к-рая поглощается анализируемым р-ром. Светофильтры изготовляют из цветных стекол. Ранее применявшиеся колориметры — колориметр Дюбоска и клиновой колориметр Аутенрита — не имели светофильтров, что снижало точность измерений. Поглощение света р-рами многих окрашенных веществ не подчиняется закону Бугера — Ламберта — Беера; в этих случаях строят эмпирические калибровочные кривые (калибровочные графики).

Различают визуальную и фотоэлектрическую К. При визуальном методе стандартных серий (метод шкалы) используют набор пробирок одинакового бесцветного стекла и диаметра. В пробирки наливают возрастающие в геометрической прогрессии количества стандартного р-ра определяемого вещества и доводят его до одного и того же объема водой или другой подходящей жидкостью (напр., этанолом). Получается шкала окрасок от самой яркой до самой слабой. Можно приготовить серии долговечных стандартных разведений. Анализируемый р-р неизвестной концентрации сравнивают со шкалой стандартов по интенсивности окраски и находят ближайший к нему оттенок. Концентрацию вещества таким образом можно определить с точностью до ±5%.

При методе разбавления окраску анализируемого р-ра доводят до окраски стандартного р-ра, разбавляя более интенсивно окрашенный исследуемый р-р до совпадения с окраской менее интенсивно окрашенного стандартного р-ра, концентрация исследуемого вещества в к-ром известна. Окраску р-ров сравнивают визуально в компараторе Вальполя.

Компаратор Вальполя представляет собой ящик, имеющий форму прямоугольного параллелепипеда, с шестью гнездами для пробирок (рис.). В передней и задней стенках имеются круглые отверстия. Отверстия задней стенки прикрыты матовым стеклом для получения однородного фона. В среднее гнездо второго ряда ставят пробирку с исследуемым р-ром, в два крайних — пробирки с соответствующими стандартными р-рами; меняя среднюю пробирку, находят стандартный р-р, по окраске совпадающий (или наиболее близкий) с исследуемым р-ром. Иногда испытуемый р-р, окрашенный более интенсивно, разбавляют водой или другим растворителем до тех пор, пока его окраска не сравнится с окраской эталонного образца. Для измерения объема удобно употреблять пробирки с делениями одинакового диаметра. Концентрацию рассчитывают по формуле

С_исп = С_ст*V_исп/V_ст

где С_исп — концентрация испытуемого р-ра, С_ст — концентрация стандартного р-ра, V_ИСП — объем испытуемого р-ра, V_CT — объем стандартного р-ра. Метод более точен, чем предыдущий.

Метод уравнивания заключается в уравнивании высоты столбов стандартного и испытуемого р-ров. Высоты этих р-ров уравниваются перемещением погружателей в специальные кюветы концентрационного колориметра КОЛ-1М, который снабжен набором светофильтров и лампой-осветителем. Концентрацию испытуемого р-ра рассчитывают, как при методе разбавления.

При фотоэлектрической Колориметрии используют фотоколориметры ФЭК-М, ФЭК-Н-57, ФЭК-56, ФЭК-60. Измерение основано на уравнивании световых потоков, проходящих через контрольный и исследуемый р-ры и падающих на фотоэлементы. Фотоколориметры высокочувствительны, точны и объективны (см. Фотометрия).

Условия фотоэлектрического анализа позволяют применить также экстракционно-фотометрический метод, когда органическим растворителем извлекают только продукт реакции, а окрашенный реактив остается в водной фазе, не мешая определению.

Для повышения точности анализа, для определения больших концентраций (в фармацевтическом анализе), устранения мешающих компонентов и влияния светопоглощения реактива применяют дифференциальный метод. В этом случае оптические плотности анализируемого и стандартного р-ров измеряют не по отношению к чистому растворителю с нулевым поглощением, а по отношению к окрашенному же р-ру анализируемого вещества с концентрацией С₀, близкой к концентрации С_исп. Фотоколориметрическое титрование проводят на приборе ФЭТ-УНИЗ. Кюветой служит стакан с магнитной мешалкой и бюреткой над ним. Поток света пронизывает содержимое стакана горизонтально и попадает на фотоэлемент. Фототок регистрируется гальванометром.

Библиография: Бабко А. К. и Пилипенно А. Т. Фотометрический анализ, М., 1974; Булатов М. И. и Калинкин И. П. Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа, Л., 1972; Коренман И. М. Фотометрический анализ, Методы определения органических соединений, М., 1975.

Ф. М. Шемякин.